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rossy85
Nuovo Arrivato

1 Messaggi

Inserito il - 25 giugno 2009 : 16:16:45

qualcuno sa dirmi come fare ad ottenere le proteine da cellule che ho gia fissato per la chip e pellettato? cio�, una volta che ho fissato le cellule come posso ottenere gli estratti proteici?

Giuliano652
Moderatore

Prov.: Brescia

6941 Messaggi

Inserito il - 25 giugno 2009 : 16:35:14

lo scopo ultimo della chip � ottenere il DNA, non le proteine

comunque si fa con una immunoprecipitazione (ChIP: Chromatin ImmunoPrecipitation). Se vuoi qualcosa di pi� specifico conviene che guardi su un protocollo, in internet se ne trovano molti. Se vuoi le proteine totali della cellula per� non so mica se si possono prendere dopo la fissazione

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Giuliano652
Moderatore

Prov.: Brescia

6941 Messaggi

Inserito il - 25 giugno 2009 : 16:42:15

ho trovato questo

http://www1.qiagen.com/products/protein/proteomics/Qproteome/QproteomeFFPETissueKit.aspx

ro85
Nuovo Arrivato

Prov.: AV
Citt�: Avellino

3 Messaggi

Inserito il - 26 giugno 2009 : 10:26:19

si si lo so che lo scopo finale � ottenere il dna ma avrei necessit� di recuperare le proteine e so di certo che si pu� fare ma non so come

angemore
Nuovo Arrivato

82 Messaggi

Inserito il - 27 giugno 2009 : 16:30:48

Allora, se ho capito bene tu hai delle cellule fissate e pellettate perch� devi fare la chip...
Il passo successivo � lisare le tue cellule, io lo faccio con un buffer cos� composto: 50mM Tris HCl pH8, 2mM EDTApH8, 0.1% NP40, 10% glicerolo e inibitori di proteasi.
Dopo si centrifuga a 3000rpm per 5' a 4�C, in questo modo si separano i nuclei (che formeranno il pellet) dalla frazione citoplasmatica (il supernatante). Quindi basta conservarti il supernatante e avrai le proteine totali citoplasmatiche (se sono queste che ti interessano).
Ognuno ovviamente segue un proprio protocollo con un buffer di lisi leggermente diverso, ma il principio � lo stesso e cio� nel momento in cui centrifughi dopo la lisi i nuclei si trovano nel pellet e il citoplasma nel surnatante.
Per conoscere la quantit� di proteine totali da caricare su gel bisogna vedere se la proteina di tuo interesse � poco o molto espressa nelle cellule e alle condizioni con cui lavori, per cui se non � riportato in letteratura dovresti fare delle prove.