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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
 Inserito il - 27 giugno 2009 : 15:24:40
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Ciao a tutti...sto leggendo un lavoro in cui per usare la tecnica del doppio ibrido hanno fatto un costrutto di fusione con Lex A. Allora mi chiedevo se Lex A è l'activation domain oppure il DNA binding domain.
Se qualcuno lo sa potrebbe chiarirmi le idee
Graziee
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
 Inserito il - 28 giugno 2009 : 17:07:22
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mmmmmm,se non ricordo male:
sono entrambi fattori di trascrizione(LEX-A è un repressore)
è stato fatto un saggio semplicemnte per verificare che un TF non deve essere necessariamente integro per svolgere la sua funzione
l'activation domain recluta la polimerasi anche se svincolato dal resto della prot di appartenenza
il DNA binding-domain lega comunque il sito promotore corrispondente anche se svincolato dalla prot di appartenenza
questo è stato provato proprio fondendo l'AD di lex-a e BD di gal-4,cioè si è creata una proteina chimerica che continuava a svolgere l'azione di TF |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2009 : 19:49:17
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Ok! Ho capito. Nel doppio ibrido quindi è utilizzabile così: prot di fusione: esca-Lex A (activation domain) contro Library di costrutti di fusione con Gal4. Se un clone è positivo: Gal4-preda, esca interagisce con preda in modo che Lex A e Gal4 possano agire da TF e trascrivere il gene reporter (con promotore riconosciuto da Gal4) cotrasfettato.
Grazieee |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2009 : 20:08:54
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no,è il contrario :D
tu stessa hai detto che il promotore è per GAL-4
quindi ti costruisci 2 plasmidi così:
1) ---GAL-4DNA-BD + bait---
2)----GAL-4AD + library----
questi 2 vettori esprimono le 2 proteine chimeriche,che se interagiscono tra di loro ottieni questo "complesso"
GAL-4DNA-BD-bait--library-GAL-4AD
che ti attiva la trascrizione del plasmide col gene reporter.
LEX-A lascialo perdere,nel senso che quell esperimento serviva solo a dimostrare che una prot di fusione può funzionare benissimo.
E nel doppio ibrido usi solo i 2 domini sempre di GAL-4 |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2009 : 23:22:44
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Allora innanzitutto silvietta82 se ci avessi detto quale era il lavoro che stai leggendo:
Citazione:
sto leggendo un lavoro in cui per usare la tecnica del doppio ibrido hanno fatto un costrutto di fusione con Lex A. Allora mi chiedevo se Lex A è l'activation domain oppure il DNA binding domain.
sarebbe stato più facile darti una risposta.
Comunque nel lavoro a cui si riferiva zerhos in cui hanno creato una proteina di fusione Gal4-LexA in realtà hanno utilizzato il "DNA binding domanin" di Lex4 e l'"activation domain" di Gal4, il lavoro è questo: A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of a prokaryotic repressor.
Per quello detto in generale sull'Yeast two Hybrid concordo, faccio solo una precisazione: esistono diversi tipi di plasmidi per fare Yeast two Hybrid.
I più utilizzati sono sicuramente quelli che utilizzano Gal4 (sia AD che BD), ma molto utilizzati sono anche quelli basati su LexA (che utilizzano il BD di LexA e AD di altri fattori trascrizionali) |
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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2009 : 10:20:06
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Grazie...ora non ricordo più esattamente l'articolo...ne sto leggendo un sacco (full immersion per esame di biologia cellulare2), cmq vi ringrazio e la prossima volta non ometterò la citazione   |
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LexA e doppio ibrido
Didattica
