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là
Utente Junior
565 Messaggi |
 Inserito il - 07 luglio 2009 : 10:54:00
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ciao carissimi!
ho un problema con i miei western e non so' più dove picchiaree la testa. mi spiego.
allora, sto usando un anticorpo primario fatto in goat per la mia proteina. rilevo al chemidoc con il pico, e la membrana diventa subito nera. Quando uso altri primari non ho lo stesso problema, e non capisco il perchè. cosa potrebbe essere, a parte chel'anticorpo contro la mia proteina fa schifo?
inoltre lo sto usando su estratti di cellule HeLa che avevo trasfettato per far esprimere la mia proteina di interesse, e mi riconosce un po' di bande aspecifiche, quindi, anche ammesso che la trasfezione sia venuta, non posso dire con sicurezza che la banda all'altezza giusta sia la mia proteina.
cmq, secondo voi, cosa potrei fare per evitare che la membrana diventi nera? le ho provate un po' tutte.....
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2009 : 20:53:10
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Innanzitutto cos'è il "pico"???
Immagino sia un kit di rivelazione molto sensibie, e questo già potrebbe essere un problema, perchè oltre a dare un segnale maggiore può aumentare anche il fondo. Se hai anche an kit meno sensibile io proverei anche con quello.
Gli anticorpi di goat tendono a dare più fondo.
Come lo diluisci il tuo primario? In TBS e basta o in una soluzione di blocco? Ti consiglio se non lo fai già di diluirlo in una soluzione di blocco.
Poi una prova che puoi fare è anche utilizzare un pezzettino di membrana incubata solo con l'anticorpo secondario e vedere se è quello che da il segnale di fondo così forte. Nel qual caso ti conviene lavorare sul secondario per diminuire il fondo.
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là
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2009 : 14:05:24
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ciao grazie!
il pico è un a soluzione di rilevazione infatti, ma è quello meno sensibile. ho usato diverse diluizioni dell'anticorpo primario da 1:200 a 1:1500, sia diluendolo in latte sia in TBS. mi sa che è il mio anticorpo che è pessimo...grazie! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2009 : 14:19:38
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| Beh prova a fare le altre prove che ti ho suggerito, puoi anche provare diverse soluzioni di blocking in cui sciogliere l'anticorpo, ad es. 5% BSA. Poi ce ne sono altre, io avevo un anticorpo in cui consigliavano anche di aggiungere 0,1% triton. |
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là
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2009 : 14:55:12
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ok proverò! grazie!
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 10 luglio 2009 : 19:16:32
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io avevo un problema simile al tuo.
l'ho risolto giocando sulle diluizioni dell'anticorpo, sia primario ma soprattutto del secondario.
per avere un segnale accettabile sono arrivato a diluire 1:10.000 il primario e 1:20.000 il secondario.
prova e riprova, vedrai che riuscirai! |
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problema western
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