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alanine
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 16 luglio 2009 : 15:33:28
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SAlve a tutti, avrei bisogno di qlche chiarimento per quanto riguarda la diluizione dei primers
io ho un primer a 51.1 nM (9 OD) e uno a 45.4 nM (9.1 OD)
ciascuno è stato diluito in questo modo:
5 microL di Primer + 45 microL di H2O
Adesso mi chiedo...a che concentrazione li ho adesso? con che calcolo lo posso sapere?
da un mio calcolo penso che dovrebbero essere a 5.11nM e 4.54 nM rispettivamente...
Ma dato che ho problemi con la pcr (il segnale è troppo debole o assente) vorrei provare a diluirli ulteriormete, che ne pensate?
...grazie mille!!!!! Attendo con ansia una vostra risposta!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 16 luglio 2009 : 15:35:40
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Citazione:
da un mio calcolo penso che dovrebbero essere a 5.11nM e 4.54 nM rispettivamente...
Esatto. Hai fatto una diluizione 1:10
Citazione:
Ma dato che ho problemi con la pcr (il segnale è troppo debole o assente) vorrei provare a diluirli ulteriormete, che ne pensate?
Io comincerei ad abbassare un pochino la temperatura di annealing. |
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alanine
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 16 luglio 2009 : 15:45:10
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Gia fatto :(, le abbiamo provate tutte:
t° abbassata da 61 a 60° e poi ancora a 58°...niente
abbiamo usato diverse quantità di Dna, da 0.5 microL a 0.8, niente...
con e senza formammide...
e poi cosa strana è che c'è sempre una banda sotto (+ giu rispetto a quella dell'amplificato)
...cosa mi condigliate? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 17 luglio 2009 : 16:06:06
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Beh più che la concentrazione dei primers che hai dovresti vedere quanti ne metti per la PCR.
Comunqe la banda che dici:
Citazione:
Messaggio inserito da alanine
e poi cosa strana è che c'è sempre una banda sotto (+ giu rispetto a quella dell'amplificato)
A che altezza si trova?
Potrebbero anche essere dimeri di primers! |
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alanine
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 17 luglio 2009 : 19:59:35
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Beh io ne metto 1 microL ciascuno (F.: 5.11nM e R.: 4.54 nM)...
vorrei provare ad aggiungerne di meno, cosi che si diluuiscono un po...nn so che fare altrimenti...
la banda si trova + giu rispetto alla banda dell'amplificato, e si vede solo nei campioni che nn si amplificano, mentre quelli amplificati nn ce l'hanno...per quetso avevo pensato che potesse essere la concentrazione dei primers il problema (sia che delle pcr che nn vengono sia della banda...) poi nn so, sono alle prime armi...aiutatemi
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 17 luglio 2009 : 20:21:21
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Citazione:
Messaggio inserito da alanine
la banda si trova + giu rispetto alla banda dell'amplificato, e si vede solo nei campioni che nn si amplificano, mentre quelli amplificati nn ce l'hanno...
Più in giù non significa molto non sapendo qualt'è l'altezza della banda di amplificato!
Comunque se le vedi solo nei campioni che non si amplificano a maggior ragione direi che sono dimeri di primers, dovrebbero essere attorno a 50bp (ma possono arrivare anche fino a 100bp)
Citazione:
Beh io ne metto 1 microL ciascuno (F.: 5.11nM e R.: 4.54 nM)
L'importante è la concentrazione finale! 1microlitro in quanto volume finale??? |
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alanine
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 18 luglio 2009 : 09:07:29
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| 25 microL |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2009 : 01:10:09
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No scusa un attimo ho prima avevo risposto senza fare molto caso alle concentrazioni, ma... sei sicura di quello che hai scritto?
Citazione:
io ho un primer a 51.1 nM (9 OD) e uno a 45.4 nM (9.1 OD)
Citazione:
io ne metto 1 microL ciascuno (F.: 5.11nM e R.: 4.54 nM)
1 microlitro di primer 5 nanoMolare??? (ho approssimato)
in 25ul sarebbe una concentrazione di 0,2 nanoMolare
Non è che intendevi microMolare? o al massimo milliMolare?
0,2 nanoMolare è 1000 volte meno della quantità che si usa normalmente in una PCR! In genere si usano primers ad una concentrazione finale 100-500nM (nanoMolare) ovvero 0.1-0.5uM (microMolare)
Comunque da quello che scrivi all'inizio:
Citazione:
io ho un primer a 51.1 nM (9 OD) e uno a 45.4 nM (9.1 OD)
basandosi sulle OD e considerando un generico primer attorno a 20nt (non so la sequenza dei tuoi) ma 9 OD corrispondono a circa 40-50 nmol (nanomoli non nanoMolare)!!!
I primer che hai ti sono arrivati già sciolti o in polvere? Se erano sciolti che volume "iniziale" avevi? (da li ti devi ricavare la concentrazione) e se erano in polvere in quanto sono stati ricostituiti???
Per intenderci se le OD sono quelle che dici per avere le concentrazioni che hai scritto dovresti avere un litro di soluzione di primer!!!
Ricontrolla bene il data sheet e i tuoi conti! |
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