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biotool
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97 Messaggi |
 Inserito il - 18 luglio 2009 : 12:12:44
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Ciao ragazze/i!
Ho una domanda da porvi: ho effettuato pcr qualitativa per valutare se determinate cellule esprimono certi geni, ho messo il mio HKG, un controllo negativo (tutto tranne templato) ed un controllo con al posto del cDNA l'mRNA estratto. risultato: banda del'HKG normale, abbondante, controllo negstivo effettivamente negativo e controllo con mRNA banda uguale come nell'HKG solo meno abbondante. Presenza di genomico non può essere perchè i primers per l'HKG sono a cavallo introne/esone, quindi se fosse genomico la banda dovrebbe essere ad un'alteza differente. Cosa può essere? Mi è stato detto in laboratorio che è già successo, ma senza sapermi dire il perchè...
Grazie!
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2009 : 11:55:36
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sicuro che i primers non sono sullo stesso esone?
avere una amplificazione solo da mRNA e' per contaminazione di genomico
a meno che facendo la quantitativa con una placca
potresti aver contaminato il pozzetto dove hai messo solo mRNA
e' vicino a quello del tuo gene????
altre spiegazioni non mi vengono in mente
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biotool
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 20 luglio 2009 : 19:55:55
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grazie della risposta!
no contaminazione del pozzetto la escludo, come sono fatti i primers ho controllato...
non è possibile una contaminazione della mix, che ci sia della trascrittasi inversa?
MAH, proprio non saprei, mi sembra curioso come fatto... |
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2009 : 17:41:14
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Che HKG stai utilizzando? se è la Beta-actina, questa se non ricordo male ha numerosi pseudogeni. Nel caso di una contaminazione da gDNA, potrebbero dare la banda che vedi.
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2009 : 19:42:31
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C'è un'alta probabilità che siano le pipette e quindi anche qualche soluzione che sia contaminata con la PCR del tuo gene... ai miei ragazzi capita spesso quando fanno ripetutamente la stessa reazione di PCR, mettere i puntali con filtro non serve a nulla se qualche soluzione è contaminata con l'uso di una pipetta sporca della pcr.
Decontamina le pipette o rifai la PCR con pipette che non hanno mai visto la tua reazione di PCR. Vedi che così il controllo negativo non ti verrà più.
Altre cose da considerare è il Peso molecolare della banda, se è circa 100 bp potrebbe essere un prodotto dei primers che si annilano tra loro.
La temperatura di annealing potrebbe essere troppo bassa, in modo che si annili male sul genomico e genera comunque la PCR un un po' di ritardo.
se usi un po' di genomico e non RNA come controllo potresti verificare se effettivamente da questo DNA esce o no un buon prodotto di PCR.
In bocca al lupo.
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biotool
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 22 luglio 2009 : 09:20:03
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è un piacere discutere con voi!
La banda è sulle 500 bp, escludo i primers, usati da tempo nel laboratorio. l'HKG è in effetti beta-actina, è interessante il discorso degli pseudogeni, ma se ci fosse cmq contaminazione da gDNA non dovrei vedere anche la banda che mi aspetto appunto dal genomico?
Proverò con pipette diverse! |
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RM
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115 Messaggi |
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biotool
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 22 luglio 2009 : 10:06:14
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| grazie mille! |
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 22 luglio 2009 : 10:09:48
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Scusa volevo solo aggiungere un'altra cosa..
"ma se ci fosse cmq contaminazione da gDNA non dovrei vedere anche la banda che mi aspetto appunto dal genomico"
Ovviamente teoricamente è così..comunque i pseudogeni per beta actina sono presenti in molte più copie rispetto al gene. Può darsi quindi che vengano amplificati in maniera preferenziale e con maggiore efficienza rispetto al locus con introni.
Ciao |
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domanda su controllo pcr!
Didattica
