| Autore |
Discussione |
|
|
farmacologia
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
 Inserito il - 27 luglio 2009 : 09:08:10
|
salve ragazzi.
avendo effettuato una immunoprecipitazione con biglie ho colorato il gel ed ho visto la proteina di mio interesse all'altezza giusta. pensavo di aver lavorato bene, quando un mio collega dottorando ha opposto un'osservazione che mi lascia perplesso  .
lui sostiene che dopo la corsa devo effettuare un wb e trattare di nuovo la membrana con l'Ab specifico per la mia proteina. io penso che tanto non ha senso, perchè la mia proteina è gia legata al complesso biglia-proteina A-Ab, per cui non ha siti di legame disponibili, per cui il wb ed il trattamento con Ab non è necessario. poichè oggi devo dare i risultati al prof. vorrei che mi aiutaste in questo problema.
grazie come al solito. 
|
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
"L'unica differenza tra me e un pazzo è che io devo mentire la mia normalità per sopravvivere a questo falso mondo"
Farmacologia |
|
|
|
|
Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2009 : 10:26:53
|
secondo me ha ragione lui. durante l'IP tu hai il complesso beads-ab-proteina però non è che puoi tenere la proteina così complessata per gli esperimenti. il complesso lo devi rompere, e poi devi eseguire un wb di conferma. chi ti dice che quella banda ch evedi sul gel non sia un aspecifico che corre allo stesso peso molecolare? puoi fare 2 cose, dipende da come è fatto l'ab che hai usato per l'IP: se hai un ab cross-linkato con le beads dopo l'IP fai il salto di pH aggiungendo glicina 1M a pH 3.5, così stacchi la proteina dal complesso ma l'ab resta attaccato alle beads perchè ha legami covalenti. poi centrifughi, recuperi il surnatante (che è la proteina) e il pellet (cioè le beads) le puoi recuperare per un altra IP. altra cosa invece quando non hai un Ab cross-linkato alle beads. in questo caso denaturi con sample buffer, rompi tutti i legami ma non recuperi l'Ab e dopo la corsa, se ti fai un comassie di controllo, dovrai vedere anche le catene dell'ab.
|
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
|
 |
|
|
farmacologia
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2009 : 15:32:04
|
quello che io ho fatto è esattamente quello che tu prospetti nella seconda situazione.
Ho rotto i legami con sample buffer, ho fatto una corsa, ho colorato con sypro ruby (perchè non ho comassie) e ho visto la mia proteina e le catene dell'anticorpo, dunque tre bande in totale.
Rifarei il wb utilizzando lo stesso ab utilizzato per ip. quindi, credo, non mi accorgerei di aspecifici.
Che ne pensi? |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
"L'unica differenza tra me e un pazzo è che io devo mentire la mia normalità per sopravvivere a questo falso mondo"
Farmacologia |
|
|
|
Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2009 : 16:25:02
|
| mah, in genere si userebbero due ab diversi, uno per fare l'IP e l'altro per il wb. in mancanza di un secondo anticorpo puoi provare ad usare lo stesso, la cosa + importante è che le catene dell'ab non si sovrappongano (come PM) alla tua proteina. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
|
|
|
|
farmacologia
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2009 : 18:45:24
|
ma cosa intendi per due ab diversi?
due ditte diverse in doppio o un altro per la coimmuno?
io non cerco interazione, almeno per adesso.
le bande non si sovrappongono, anzi sono ben nette e all'altezza giusta. |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
"L'unica differenza tra me e un pazzo è che io devo mentire la mia normalità per sopravvivere a questo falso mondo"
Farmacologia |
|
|
|
Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2009 : 09:41:17
|
| due cloni diversi, tipo un rabbit per l'IP e un mouse per il blot. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
|
|
|
|
farmacologia
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2009 : 16:57:01
|
| ok. grazie davvero!!!!!!!!! |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
"L'unica differenza tra me e un pazzo è che io devo mentire la mia normalità per sopravvivere a questo falso mondo"
Farmacologia |
|
|
| |
Discussione |
|
immunoprecipitazione
Didattica
