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Mareluna
Nuovo Arrivato
Prov.: Treviso
16 Messaggi |
 Inserito il - 04 agosto 2009 : 16:02:51
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Ciao a tutti! Sono mesi che ho un problema con delle PCR e non ne vengo a capo: sto tentando di amplificare 2 geni di interesse da DNA genomico facendo una mix unica contenente i 4 primers per i 2 geni. Le prime PCR di prova hanno dato un risultato quasi splendido (la fortuna del principiante) ma da parecchio non vogliono più saperne di venire bene. Ho provato più volte ad amplificare gli stessi templati venuti bene inizialmente per avere la certezza che non si trattasse di un problema di estrazione del DNA, ma un giorno vengono e un giorno no!! ma è possibile??
Ho provato a sostituire tutti i reagenti, ridiluire i primers...ho cambiato anche termocycle e analizzato diverse temperature di annealing per essere sicura di utilizzare quella ottimale....ma nulla! Uno dei due geni viene decentemente ma il secondo è solo uno smear!
Non so più cosa fare....qualcuno avrebbe qualche consiglio?
Grazie mille!
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
Inserito il - 04 agosto 2009 : 16:11:05
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| E' sempre lo stesso il gene che viene bene? Se effettui la PCR solo per il secondo gene che non viene (facendo quindi una PCR normale), hai amplificato? Se sì allora potresti avere competizione tra le 2 reazioni, nel senso che hai due reazioni che richiedono l'intevento della taq e nucleotidi. Forse per uno dei due geni hai primers migliori che si appaiano più facilemente e sbilanciano la reazione ottendo un solo amplificato. Ma è solo un'idea, aspetto una tua eventuale conferma alle mie domande. |
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
Inserito il - 04 agosto 2009 : 16:14:43
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Citazione:
Messaggio inserito da marok
E' sempre lo stesso il gene che viene bene? Se effettui la PCR solo per il secondo gene che non viene (facendo quindi una PCR normale), hai amplificato? Se sì allora potresti avere competizione tra le 2 reazioni, nel senso che hai due reazioni che richiedono l'intevento della taq e nucleotidi. Forse per uno dei due geni hai primers migliori che si appaiano più facilmente e sbilanciano la reazione ottendo un solo amplificato. Ma è solo un'idea, aspetto una tua eventuale conferma alle mie domande.
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Mareluna
Nuovo Arrivato
Prov.: Treviso
16 Messaggi |
Inserito il - 04 agosto 2009 : 16:15:48
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Viene meglio sempre lo stesso gene, cosa che cmq mi aspetto, ma il problema è che il secondo gene inizialmente veniva bene e ora non più. Ho già provato a fare 2 PCR separate e il risultato non è cambiato quindi ho escluso il problema di competizione che avevo sospettato anche io.
Sono davvero allibita... |
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agosto
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2009 : 16:21:12
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Ciao, hai cambiato anche l'acqua che usi per la PCR? In tesi ho avuto un problema simileche ho risolto bollendo l'acqua: era contaminata da una nucleasi forse presente in qualche muffa che non era visibile a occhio nudo.
Spero tu riesca presto e risolvere. Ciao Agosto |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2009 : 18:23:27
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I misteri insondabili della PCR!!!
A me una volta è successo che non funzionasse più niente, ho cambiato tutto, persino laboratorio... ma niente, poi sono andata in vacanza e al mio ritorno a Settembre rifunzionava tutto alla perfezione. Non ho mai capito il perché!
Comunque a parte il consiglio di andare in vacanza, prova a riordinare i primers nuovi. Hai detto che li hai ridiluiti ma non se ne hai acquistati di nuovi, magari si sono danneggiati. |
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
Inserito il - 06 agosto 2009 : 11:56:06
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Magari le prove venute bene le hai fatte in inverno? Non so perchè con il fresco le PCR vengono sempre meglio, poi arriva l'estate e si salvi chi può...non so sarà l'umidità, la pressione o non so che altri fattori incontrollabili, ma fatto sta che l'estate è meglio andare in vacanza... (questo non vale per GFPina perchè anche di estate lassù fa un bel freschino  e poi più ore di sole...più ore per lavorare  ) |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 agosto 2009 : 12:11:48
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Citazione:
Messaggio inserito da marok
(questo non vale per GFPina perchè anche di estate lassù fa un bel freschino e poi più ore di sole...più ore per lavorare )
Infatti tra 2 giorni sono in vacanza!!! E per stare ancora più al fresco vado in Lapponia!
Comunque concordo sul fatto delle PCR e il caldo, è una cosa abbastanza comune! Quella volta che non mi venivano ad Agosto ero appunto in Italia! |
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Mareluna
Nuovo Arrivato
Prov.: Treviso
16 Messaggi |
Inserito il - 06 agosto 2009 : 16:40:23
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Guardate, lo scorso anno ho avuto lo stesso problema di PCR ad agosto che è durato per circa un mese e mezzo..poi miracolosamente passato tutto! Ho cambiato tutto, acqua, primers (riordinati), termocycle....tra un pò provo a cambiare me e vediamo come va :-p!
Che sia un problema di temperatura lo aveva pensato anche io..ma alla fine nel mio lab non si soffre il caldo, siamo sempre climatizzati....mah..non so più che dire...ormai andrò in vacanza e se ne riparlerà a settembre! i misteri della scienza......
Cmq grazie a tutti per i consigli!
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problemi PCR
Didattica
