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erika.melissari
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
 Inserito il - 07 agosto 2009 : 11:04:55
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Salve a tutti.
Vorrei sapere se qualcuno di voi ha esperienza nell'usare mRNA proveniente da trasfezione transiente in studi di confronto di espressione genica.
Ho letto nel forum che la grossa capacità della trasfezione transiente è quella di produrre molte proteine in poco tempo.
Mi domandavo se i livelli di espressione dell'mRNA rispecchiano quelli reali e quindi se l'mRNA può essere utilizzato in esperimenti che servono per validare l'espressione genica.
Ho letto che per esempio la variabilità fra cloni se si confrontano i livelli di espressione è molto più alta che se si effettua una trasfezione stabile. E' vero?
Vi ringrazio per i vostri commenti
Erika
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2009 : 11:22:06
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Che vuol dire "rispecchiano quelli reali"?
Se per 'reali' intendi i livelli del gene endogeno
la risposta è no nel modo più assoluto. Se invece
intendi una corrispondenza numerica fra trascritti
e proteine, allora dipende dall'emivita della proteina
(che puoi comunque velocizzare, aggiungendo sequenze PEST)
Citazione:
Ho letto che per esempio la variabilità fra cloni se si confrontano i livelli di espressione è molto più alta che se si effettua una trasfezione stabile. E' vero?
Certo, questo perchè quando fai una transiente e poi estrai
le cellule quella che vai a misurare è un'espressione "media". |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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erika.melissari
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2009 : 11:34:05
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Grazie Dionysos per la risposta rapida.
Per "reali" intendo quelli che si avrebbero se il DNA che trasfetto fosse nel su "ambiente di origine".
Mi spiego meglio. Se voglio studiare il profilo trascrizionale di un gene mutato rispetto a quello di un gene sano ed effettuo la loro trasfezione transiente in una linea cellulare è verosimile che i livelli di espressione dei geni indotti dal trasfettato che osservo nelle cellule ospiti rispecchino quelli originari? La trasfezione transiente mi "garantisce" in questo senso?
Grazie ancora
Erika |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2009 : 12:04:44
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Purtroppo questo è un obiettivo difficile se non impossibile da raggiungere così:
un gene transfettato è un gene che si trova nel contesto di un vettore, e non
nel suo locus d'origine. La mancanza di introni, la presenza di un TSS e di un
segnale di polyA "non originali", la mancanza degli enhancers/silencers/insulators
ma soprattutto del contesto epigenetico proprio al locus originale rendono del
tutto approssimativo ogni tentativo di ricapitolare l'espressione del gene endogeno,
cioè quello naturalmente espresso dalle cellule, anche considerando un clonaggio
sotto promotore endogeno. (al quale, immagino, tu stai pensando)
Secondo me i livelli di mRNA non avranno mai nulla a che vedere ma questo
non significa che l'espressione proteica non sia rappresentativa perchè l'emivita
della proteina sarà comunque paragonabile a quella dell'endogena. Avrai un
certo margine di errore, che è inevitabile, e questo dipenderà in larga misura
dall'organismo ospite che stai usando (ad es. se è un gene neuronale e lo esprimi
in una linea neuronale, il margine d'errore sarà presumibilmente minimizzato, ma
non è detto) ma dipende anche dal tipo di gene: ci sono geni come quello della
beta-globina che, se clonati senza introni, vengono espressi cento volte di meno.
L'unica alternativa valida per testare geni mutati nel
loro locus è quella di fare gene targeting anzichè transfezione
(con tutti i problemi di inefficienza e sbattimento che comporta) |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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erika.melissari
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2009 : 12:15:27
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Grazie ancora.
Erika |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2009 : 12:17:39
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Prego |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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trasfezione transiente ed espressione genica
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