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tambua
Nuovo Arrivato
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 Inserito il - 18 agosto 2009 : 19:55:02
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Salve ragazzi,
vengo subito ad esporvi il mio quesito:
Supponiamo di dovere studiare l'interazione tra due proteine e di volere sfrtuttra un sistema quale quello della coimmunoprecipitazione.In pratica, si utilizzano delle beads leganti la proteina A di stafilococco, altamente affine nei riguardi della porzione Fc delle Ig, e si sensibilizzano con l'anticorpo specifico per la proteina di interesse; si mette a contatto l'estratto proteico e, qualora esso contenga la proteina verso cui l'anticorpo è rivolto, quest'ultima rimarra legata alle beads, risultando purificata dal resto che potrà essere separato per centrifugazione. Ora, qualora, quest'ultima stesse interagendo stabilmente con una seconda proteina, ci sarebbero buone possibilità che questa venga coimmunoprecipitata insieme alla prima.
Il mio quesito diventa:
Come faccio a sapere che due proteine sono coprecipitate?
Se volessi fare un westernblotting ovviamente passando da una elettroforesi in condizioni denaturanti, il fatto che la prima proteina sia legata ad un anticorpo si risolve con le condizioni denaturanti stesse? E lo stesso non varrebbe anche per l'interazione tra le due proteine?
Spero di non essere stato eccessivamente contorto.
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 18 agosto 2009 : 20:21:41
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Per fare un wb ai campioni devi aggiungere del Laemmli che è un forte denaturante, che quindi rompe tutti i legami tra proteine. Quindi permette il distacco degli Ab dalla prot A, il distacco della prima prot dall'Ab e il distacco delle eventuali 2 proteine interagenti fra loro. Se sul Wb fai diversi Ab puoi vedere le diverse proteine.
Spero di aver risposto alla tua domanda... |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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tambua
Nuovo Arrivato
50 Messaggi |
Inserito il - 18 agosto 2009 : 21:30:32
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Grazie Domy sei stata molto gentile oltre che naturalmente preparata.
Rimane solo un'ultima quesito,come faccio a sapere visto che si separano e vengono rivelate con Ab diverse, che le due proteine erano legate? Questo credo che così non si sappia :0 |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 19 agosto 2009 : 09:16:46
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Se fai un immunoprecipitato significa che lavi via tutte le altre proteine, quindi sul gel caricherai solo le proteine che interagiscono con la tua. Questo significa che se riveli una proteina sul gel significa che interagiva con la tua prot. Quelle che non riveli le hai lavate via precedentemente.
Citazione:
Grazie Domy sei stata molto gentile oltre che naturalmente preparata.
Eh...è la seconda volta che mi prendono per donna...questo nickname deve proprio dare confusione...dovrò cambiarlo
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=5342&whichpage=3 |
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tambua
Nuovo Arrivato
50 Messaggi |
Inserito il - 19 agosto 2009 : 10:43:32
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Grazie mille, anche se ci sarei dovuto arrivare da solo..che vergogna! 
Leggo che sei di Napoli, io di Catania...e poi dicono che al sud non si studia..mah!!
Grazie ancora! |
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Coimmunoprecipitazione e western blotting
Didattica
