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happyele
Nuovo Arrivato
27 Messaggi |
 Inserito il - 22 agosto 2009 : 18:45:22
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Ciao a tutti! Mi è capitata una domanda un po' stupida a cui però non sapevo rispondere!In vista dell'esame la pongo a voi:
<<Perché il DNA si denatura immergendolo in una soluzione di carbonato di sodio a pH 11? A cosa serve e in quale processo serve questa denaturazione?>>
Il linguaggio è del prof..ho fatto solo copia e incolla!
Grazie 1000!!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
 Inserito il - 22 agosto 2009 : 21:49:01
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Caro heppyele,
La domanda che hai posto non é per nulla stupida. In vita mia non ho mai sentito questa procedura di denaturazione del dna, anche se di protocolli ne ho fatti di cotti e di crudi.
La risposta dipende soprattutto dal contesto.
Quello che conosco che é più vicino a quanto dici é l'estrazione del dna dai batteri. Tuttavia non coincide al 100%.
1) non so se il dna si possa denaturare con pH 11, anzi, un esposizione prolungata o in presenza di calore puoi provocare cross-linking e depurinazione, quindi degradazione del dna.
2) nell'estrazione del dna dai batteri si usa NaOH e bicarbonato, ovvero carbonato di sodio per 3 ragioni. La prima é per rompere le membrane batteriche e salificare gli acidi grassi solubilizzandoli. In questo modo porti tutto in soluzione, compreso il dna. La seconda ragione é che degradi subito l'RNA. La terza é coordinata con l'SDS (un sapone) che con quel pH si ionizza e denatura molto bene le proteine che saranno portate via con le membrane quando precipiteranno in una fase successiva in cui il pH ritornerà a 7.
Però prendi questo che ti scrivo con le dovute cautele, poiché ti ripeto che non coincide molto con la domanda che hai posto.
L'unica denaturazione da pH alcalino che conosco é il southern, dove il DNA si depurina a pH acido e si denatura con NaOH, ma lì il pH é ben oltre 11, mi pare che usavo NaOH 0,5 N, cioé quasi pH 14 in presenza di NaCl. In quel caso l'NaOH serve per mantenere il DNA denaturato a singolo filamento.
Un pH così elevato ionizza le basi azotate del dna e non si possono formare i ponti ad idrogeno che tengono insieme le due eliche. Lo stesso capita con pH molto bassi, ma la depurinazione é molto più rapida in questo caso, quindi inutilizzabile per la sola denaturazione.
Nel tuo caso hai una base molto debole e un pH relativamente modesto per ottenere una buona ionizzazione del DNA. Tuttavia se il tuo prof é convinto che pH 11 basti... sarà così
In bocca al lupo per l'esame
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happyele
Nuovo Arrivato
27 Messaggi |
Inserito il - 22 agosto 2009 : 23:51:49
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Ciao Neuroscience!
Sono qusi sicura che si tratti di Southern..infatti le slide del prof dicono:<<Dopo aver separato gli acidi nucleici per elettroforesi,il gel viene immerso in una soluzione a pH>10 per denaturare i polinucleotidi,poi si fa un trasferimento delle bande su un foglio di nitrocellulosa o di nylon,ecc ecc..>>..del carbonato di sodio non parla minimamente..
L'unica cosa è che più in là nei miei appunti ho scritto:
<<blottare=farlo rimanere su filtro;lo faccio col carbonato di sodio(base)..il dna denatura(restando nello stesso posto nel gel)..i due filamenti sno separati..rimangono appiccicati al filtro.
Io so che il dna è sensibile a ph e tipo di solvente,ma lui chiede proprio come la soda lo denatura a ph 11!
Crepi il lupo! |
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 23 agosto 2009 : 18:41:59
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Soda e carbonato di sodio nn sono la stessa cosa! |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 23 agosto 2009 : 19:23:46
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In realtà il problema a mio parere è che il termine soda è molto ambiguo.
In italiano con soda si intende l'idrossido di sodio = NaOH
Il carbonato di sodio, Na2CO3, a quanto dice wikipedia (ma potrebbe essere falso) "è stato chiamato a lungo soda, ma non è da confondere con la soda caustica".
In inglese:
washing soda = Na2CO3
baking soda = NaHCO3
caustic soda = NaOH |
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 23 agosto 2009 : 19:58:32
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| Concordo con wikipedia |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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happyele
Nuovo Arrivato
27 Messaggi |
Inserito il - 23 agosto 2009 : 21:19:38
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 Se leggete la domanda,ragazzi,si parla di carbonato di sodio.
Penso di sapere ormai a memoria come funziona il southern:la soluzione è alcalina..si parla di NaOH..mai di pH=11 e mai di intervento del carbonato di sodio nella denaturazione.
Sono alquanto avvvilita..non so più dove cercare e il dubbio resta.
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happyele
Nuovo Arrivato
27 Messaggi |
Inserito il - 23 agosto 2009 : 21:21:36
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| ps:soda l'ho trovato su wikipedia! |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 24 agosto 2009 : 02:21:08
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sono sicurissimo che soda é un termine arcaico per riferirsi al sodio, poi l'ulteriore specifica 'caustica' identifica NaOH.
Ad ogni modo, cercando un po' su internet ho verificato che il dna inizia a denaturarsi a pH 11, e che questo pH si può ottenere con il carbonato di sodio.
C'é una discrepanza con il tuo protocollo di southern blot. La denaturazione del dna deve avvenire prima del passaggio sulla nitrocellulosa, ed il blot é fatto con il cross-linking (radiazioni UV).
Però quando ero tesista facevo un protocollo che sembra simile a quanto hai scritto.
In pratica dovevamo cercare un clone batterico che integrava un nostro vettore modifcato. Le probabilità erano troppo basse per cui facemmo una specie di southern, di cui non ricordo il nome, per cercare il clone buono.
Pendevamo i batteri e li strisciavamo su una piastra grigliata, poi mettevamo sopra un foglio di nitrocellulosa che veniva lavato con una soluzione che rompeva i batteri e denaturava il dna. Blot con UV per fissare e con una sonda radioattiva si cercava la colonia giusta.
Questo coinciderebbe un po' di più con il tuo protocollo.
Ad ogni modo ti ringrazio, cercando qua e là ho scoperto varie cose interessanti
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happyele
Nuovo Arrivato
27 Messaggi |
Inserito il - 24 agosto 2009 : 12:03:25
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una discrepanza?strano..sono le slides del prof!noi poveri studenti non abbiamo avuto ancora l'onore di entrare in laboratorio,se non per vedere come funzionano le pipette..sto imparando a memoria cose che spero,prima o poi,potrò mettere in pratica..per questo non posso nè confermare nè smentire ciò che mi dite!
CiaoCiao! |
"Solo chi si strazia nelle domande per trovare risposte va avanti;solo chi non cede alla comodità di credere in Dio per aggrapparsi a una zattera e riposarsi può ricominciare di nuovo."(O.Fallaci) |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 24 agosto 2009 : 12:39:30
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uhmm... lo so,
sono cose che persino chi ha anni di laboratorio alle spalle potrebbe trovare "insolite"
per discrepanza intendevo l'ordine con cui fai le cose
Nel southern blot (tecnica abbastanza diffusa) si fa prima la denaturazione, poi il blot
nella tecnica che ti ho accennato e che non so bene come si chiama fai prima il blot e poi la denaturazione.
per quanto riguarda i tuoi appunti...
1) col carbonato di sodio(base) il dna denatura (restando nello stesso posto nel gel) (vero) = a quanto pare il carbonato di sodio potrebbe dare pH 11 e quindi lo potresti usare proprio per denaturare il DNA.
Lascia perdere che quasi tutti lo fanno con NaOH e NaCl, che servono rispettivamente a portare a pH denaturante e condurre corrente, il carbonato di sodio è un sistema che può fare entrambe le cose
2) blottare=farlo rimanere su filtro (vero): nel southern in genere si usano gli UV che creano legami crociati e covalenti tra la membrana ed il DNA
..i due filamenti sno separati..rimangono appiccicati al filtro (vero).
in bocca al lupo per l'esame
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happyele
Nuovo Arrivato
27 Messaggi |
Inserito il - 24 agosto 2009 : 13:32:55
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| Crepi..e grazie 1000 di tutto! |
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