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mollichina di pane
Utente Junior

121 Messaggi

Inserito il - 27 agosto 2009 : 11:36:58

Ciao a tutti! Spero abbiate trascorso delle buone vacanze!

Avrei una domanda da porvi...

...devo clonare un gene in un vettore. Dopo la reazione di restrizione ho notato che il mio inserto era corso sul gel ad un'altezza superiore di circa 100bp rispetto a quella originaria (mi riferisco all'altezza relativa alla PCR iniziale).
Vorrei sapere se a qualcuno di voi è capitata la stessa cosa e se c'è una spiegazione.

Grazie!

miky76
Utente Junior

126 Messaggi

Inserito il - 27 agosto 2009 : 13:10:35

ciao

scusa ma non ho capito

tu hai fatto una PCR
e poi hai digerito la PCR e hai messo il prodotto nel vettore?

poi hai clonato

e dopo di nuovo hai cortato per vedere se hai colonie positive
e il frammento che ottieni e' 100pb piu piccolo del prodotto PCR originario

ho capito bene?

la domanda (forse stupida) e'
hai cambiato gli enzimi di restrizione per analizare le colonie?
in modo che tagli dentro il prodotto PCR e quindi e' normale che sia piu piccolo

GFPina
Moderatore

Città: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 27 agosto 2009 : 13:45:13

No credo che intendesse che ha fatto la PCR, ha tagliato con ER e poi ha fatto migrare su gel il prodotto della restrizione.
Il prodotto di restrizione migra su gel 100bp in più rispetto al prodotto di PCR originario quindi: tagliato è 100bp più grosso del "non" tagliato!

Domanda: ma il frammento tagliato presenta estremità coesive?
L'unica cosa che mi viene in mente è che le parti a "singolo filamento" possano rallentarne la corsa... ma non saprei, in pratica non ho mai fatto una cosa del genere.

mollichina di pane
Utente Junior

121 Messaggi

Inserito il - 28 agosto 2009 : 12:54:43

E' esattamente come dice GFPina.
Prima di fare la ligation faccio correre su gel l'inserto e il vettore (poi taglio le bande, estraggo e ne ricorro un pochino per quantizzare occhiometricamente tramite confronto con un vettore a concentrazione nota).
Effettivamente l'inserto ha estremità coesive, perchè ho potuto tagliare solo con un enzima (ecoRI)per vari problemi...
La cosa ancora più strana è che dopo il taglio con ER il frammento migra circa 200 bp più in alto. Dopo il taglio della banda e la sua estrazione dal gel con conseguente corsa per quantizzazione, l'inserto migra circa 100 bp più su (cioè si abbassa leggermente ma non in modo tale da avere l'altezza originaria della PCR).
AIUTOOOOO!!!!

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