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lunatuning
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 Inserito il - 07 settembre 2009 : 16:48:34
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Salve a tutti ho un problema urgente...
questo è il testo di un esercizio d'esame di biologia molecolare 2 :
2.In figura è indicato il profilo di eluizione della una cromatografia a scambio anionico di una miscela di proteine contenente transferrina (picco 1) ovalbumina (picco 2) e Beta-lactoglobulina (picco 3). Tale miscela sospesa in 20mM Tris, pH 8.5, viene separata con gradiente salino da 0 a 0.4M di KCl (indicato in figura dalla linea nera che taglia il cromatogramma).
a.Si indichi qual è la carica della resina e quella complessiva (positiva o negativa) delle singole specie proteiche mettendole in ordine di carica crescente in base al tempo di eluizione
b.Indicare se il pI delle singole specie è maggiore o minore di 8.5, cioè del pH in cui avviene la separazione, indicando in ordine crescente i pI di ciascuna proteina.
il grafico non so come metterlo ma immaginate sulle x il tempo sulle y l'abs e 3 picchi:
-il primo medio in altezza quindi medio come valori di assorbanza e con picco a tempo 1.7
-il secondo ultimo in altezza e con picco a 2.5 di tempo
-il terzo primo in altezza e con picco a 3.5 di tempo
è un grafico molto approssimativo quindi a spiegarvelo è difficile...
io come prima risposta ho pensato che essendo uno scambio anionico la resina ha carica positiva e quindi le 3 proteine hanno via via carica negativa maggiore è giusto?
ma non so come rispondere al punto b.
qualcuno sa aiutarmi?? grazie mille!
provo ad allegarvi il file!
Allegato:  grafico.doc
3590,64 KB
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lunatuning
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Inserito il - 09 settembre 2009 : 18:53:52
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siete stati tutti molto gentili!  |
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Neuroscience
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Inserito il - 09 settembre 2009 : 19:34:36
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Ho pochissimi secondi ed ho letto molto velocemente quello che hai scritto...
ad occhio direi che non c'è bisogno di vedere il grafico allegato
per pI immagino tu ti riferisca al punto isoelettrico, ovvero quel pH a cui non c'è carica netta dello ione/molecola in esame.
Se sono stati separati per carica le proteine avranno certamente un pI diverso da quello del carrier 8.5 altrimenti arriverebbero tutti più o meno allo stesso tempo.
Essendo uno scambio anionico si dovrebbe intendere una separazione di cationi, infatti il pH è alcalino per esaltare le differenze delle cariche negative.
il pI delle sostanze sarà certamente acido, quindi inferiori al pH del carrier.
L'ovalbumina se non ricordo male ha un pI abbastanza acido, nel vino è importante saperlo per la chiarificazione... quindi ci troviamo.
Ora l'ordine di arrivo
chi arriverà per primo ad uscire dalla colonna: quello con più cariche positive ed un pI più distante dal pH del carrier, oppure quello che ha il punto isoelettrico più vicino al pH?
Se hai capito come funziona lo scambio ionico puoi rispondere a questa domanda banale e saprai anche la scala del pI
in bocca al lupo
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lunatuning
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Inserito il - 10 settembre 2009 : 01:32:17
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| grazie mille!! sei stato gentilissimo a sto punto penso che chi uscirà prima dalla colonna saranno quelli ad avere cariche positive quindi pI distante dal pH de carrier e man mano il pI diventerà sempre più acido!! :) grazie grazie |
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Neuroscience
Utente
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Inserito il - 10 settembre 2009 : 09:48:49
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scusami, per la fretta ti ho indotto in errore
se hai un pH 8,5
ed una sostanza A con pI = 4
B pI = 5
C pI = 6
La sostanza A (Acida) a pH 8,5 sarà più ricco di cariche negative come lo sarebbe ad esempio CH3COO(-)
rispetto alla sostanza C.
Di fatti è uno scambio di anioni (cariche negative) tra il carrier e le sostanze da separare
Chi ha più cariche negative resterà intrappolato tra le cariche positive della resina per più tempo, mentre chi ha meno cariche negative o addirittura neutro passerà tranquillamente la resina senza ritardi.
Resina+ Proteina--- tempi di eluizione lunghi
Resina+ Proteina- tempi di eluizione brevi
Resina+ Proteina tempi di eluizione simili al carrier (tempo morto)
Se la Trasferrina è la prima ad uscire avrà un pI molto più simile al carrier, ovvero alto
poi l'ovalbumina, poi la lactogloblunina etc...
Per la fretta stavo pensando alle cariche positive, ma a pensarci bene un pI acido vuol dire avere delle cariche negative a pH alcalino
Spero di essere stato chiaro
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lunatuning
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Inserito il - 10 settembre 2009 : 09:55:12
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ok ma come faccio in base al pI poi a risalire al pH??
xke ho un altro esercizio dove ho 4 proteine generiche
A con pI 10.2
B con 9.3
C con 6,2
D con 11.2
e devo trovare il pH e so che ho un pH del buffer a 7,2.
in più devo dire se la resina ha carica positiva o negativa e indicare il sale opportuno per creare un gradiente |
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Neuroscience
Utente
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Inserito il - 10 settembre 2009 : 09:57:46
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| trovare il pH di cosa? |
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lunatuning
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Inserito il - 10 settembre 2009 : 10:00:38
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scusa no pH ma carica assunta...
la tabella è così costruita
PROTEINA pI CARICA NETTA A pH 7,2
A 10,2 .....
b 9,3 ....
c 6,2 ....
d 11,2 ....
e devo trovare la carica netta e in piu quello che ti ho gia detto quindi
la carica della resina e il sale più opportuno |
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Neuroscience
Utente
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Inserito il - 10 settembre 2009 : 10:21:27
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A è alcalino e sarà positivo a pH7,2 quindi carica netta positiva
B un po' meno positiva
c negativa
d carica positiva
Dovresti utilizzare probabilmente una resina a scambio cationico,
per il sale non saprei proprio che dirti
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lunatuning
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Inserito il - 10 settembre 2009 : 10:23:53
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ok grazie mille! mi sei stato di aiuto...
posso chiederti una cosa? l'ultima promesso...
i due metodi più usati per separare proteine in base alla massa seconto te son la cromatografia liquida e l'sds page o sto pensando troppo in grande e sto prendendo un granchio?
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Neuroscience
Utente
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Inserito il - 10 settembre 2009 : 12:12:08
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la cromatografia liquida non è una tecnica ma un tipo di cromatografia
io conosco la cromatografia ad esclusione (in cui proteine di massa maggiore passano più rapidamente di quelle molto più piccole)
e l'sds page è una tecnica per valutare solo la massa della proteina minimizzando, per quanto possibile l'effetto dovuto alla forma della proteina ed alle sue cariche.
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lunatuning
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Inserito il - 10 settembre 2009 : 12:14:09
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quindi alla domanda i due metodi maggiormente in uso per separare le proteine in base alla loro massa tu come risponderesti?
purtroppo dalle dispense che mi ha dato la prof non è ben spiegato quando usare uno e quando un altro...  |
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Neuroscience
Utente
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Inserito il - 10 settembre 2009 : 12:46:58
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bhé te l'ho già scritto
una è sicuramente l'SDS PAGE, che fa parte del Western Blot, è per definizione una tecnica elettroforetica per valutare la massa proteica
(si maschera la carica elettrica proteica con l'SDS e si denaturano le proteine per minimizzare l'effetto della forma durante la migrazione)
Si usa per il Western fondamentalmente, ovvero una separazione netta qualitativa e non quantitativa.
Il recupero della proteina è praticamente assente, poche tecniche riescono a recuperare le proteine dal gel e rimetterle in soluzione.
l'altro, secondo me, può essere l'esclusione molecolare, che separa le sostanze per dimensioni, quindi anche qui in pratica si separano per massa le proteine.
(qui la tecnica è più grossolana nel dividere le proteine, ma si recuperano le proteine suddivise per peso molecolare) con questo esperimento le proteine ce le hai ancora in soluzione, non denaturate e pronte all'uso abbastanza suddivise per peso molecolare.
Poi ci saranno anche altre versioni che al momento non ricordo, però credo che siano più che valide queste
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lunatuning
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Inserito il - 10 settembre 2009 : 12:49:24
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| ok grazie mille!!! ti saprò dire com'è andata!! grazie grazie grazie |
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-maddy-
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Città: cagliari-torino
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Inserito il - 10 settembre 2009 : 21:21:12
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ciao!...premettendo che son d'accordissimo sul fatto che la metodica più usata sia l'SDS PAGE, a proposito di cromatografia, esiste anche questa che (non saprei con certezza) forse potrebbe essere utilizzata per separare le proteine in base alla loro massa, si chiama :Cromatografia per permeazione di gel (GPC) o per filtrazione su gel
nel dubbio ti passo gli appunti di 1 mia dispensa del lab. di neurochimica che ho frequentato nella specialistica
Cromatografia per permeazione di gel (GPC) o per filtrazione su gel
In questo caso la fase stazionaria è sotto forma di granuli di un gel provvisto di legami crociati che contiene pori di una dimensione distinta. Le dimensioni dei pori sono controllate in modo che a livello molecolare essi agiscano da “cancelli” che escludono le molecole più grandi lasciando passare quelle di dimensioni minori. questo effetto di sbarramento non è tuttavia un fenomeno “tutto o niente”: le molecole di dimensioni intermedie entrano in parte nei pori. Una colonna riempita di questi granuli (fig. 17) avrà al suo interno due volumi potenzialmente disponibili al passaggio delle molecole, cioè Vi, il volume che circonda i granuli, e Vii, il volume all’interno dei pori. Se si pone un campione sopra la colonna la fase mobile trasporterà i componenti del campione lungo la colonna a velocità diverse a seconda delle loro dimensioni molecolari. Uno molecola molto grande avrà accesso a tutto il Vi ma non al Vii e verrà perciò eluita molto rapidamente. Una molecola molto piccola avrà accesso a tutto il Vi e a tutto il Vii e perciò dovrà passare attraverso tutto il volume della colonna prima di emergere, impiegando un
tempo maggiore. Le molecole di dimensioni intermedie avranno accesso a tutto il Vi ma solo a
parte del Vii e verranno eluite ad un tempo intermedio, in ordine di dimensione decrescente.
Tra le possibili applicazioni della GPC vi è la possibilità di stimare la massa molecolare di una sostanza calibrando la colonna con molecole a massa molecolare nota. Ancora è possibile separare in un campione i componenti a bassa ed alta massa molecolare; ad esempio dissalare o purificare un estratto proteico mediante passaggio attraverso una colonna di Sephadex (gel di destrano) è più veloce ed efficiente di altri processi di purificazione.
In ogni tecnica cromatografica i componenti del campione lasciano la colonna a tempi di eluizione diversi e vengono quindi monitorati mediante un rivelatore adatto. Le risposte del rivelatore sono registrate su carta o su uno schermo sotto forma di un cromatogramma. Idealmente le molecole del campione verranno separate completamente e la rivelazione dei componenti porterà ad una serie di picchi distinti che corrispondono a ciascun tipo di molecola. Tuttavia, per minimizzare la possibilità di picchi sovrapposti o di picchi composti da più di un componente è importante massimizzare l’efficienza della separazione che dipende:
- dalla selettività, misurata dai tempi di ritenzione relativa dei due componenti; ciò dipende dalla capacità del metodo cromatografico di separare due componenti con proprietà simili;
- dalle proprietà di allargamento delle bande del sistema cromatografico, che influenzano la larghezza dei picchi e che sono dovute soprattutto agli effetti di diffusione.
Si ottiene una buona risoluzione quando c’è una grande distanza fra i massimi dei picchi e i picchi sono i più stretti possibile. Anche la quantità di sostanza presente nel campione può influenzare la risoluzione del sistema; per sistemi che mostrano bassa risoluzione può essere difficile rilevare piccole quantità di un componente particolare in presenza di grandi quantità di un secondo componente. Per migliorare la risoluzione dei sistemi a cromatografia liquida si può intervenire sui seguenti fattori:
- dimensioni delle particelle della fase stazionaria: più piccole sono le particelle maggiore sarà l’area disponibile per la ripartizione tra fase mobile e stazionaria.
- La pendenza del gradiente nei sistemi che lo utilizzano.
- La velocità di flusso che deve essere abbastanza lenta da permettere una ripartizione efficace tra la fase mobile e quella stazionaria ma abbastanza veloce da assicurare che la diffusione lungo la colonna sia minima una volta che le molecole sono state separate.
- L’impaccamento delle colonne deve essere corretto e tale da evitare un flusso non uniforme con formazione di vortici.
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lunatuning
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Inserito il - 11 settembre 2009 : 00:01:39
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| grazie mille!! :) |
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cromatografia a scambio anionico e pI
Didattica
