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viodice88
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: casandrino
41 Messaggi |
 Inserito il - 07 settembre 2009 : 18:12:17
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salve! qualcuno saprebbe aiutarmi a chiarire un attimo quali sono i passaggi della maxiprep? ho già fatto l'esamee,ma la prof ha avuto da ridire su quello che sapevo, magari anche se avete qualche link..grazie mille! :)
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violetta iodice |
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là
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2009 : 18:18:55
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| tu che hai detto? |
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viodice88
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: casandrino
41 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2009 : 18:25:54
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allora ti scrivo tutto quello che so, anzi, copiando anche dai suoi appunti -.-''
prendo 500 mL di coltura batterica liquida, rompo la parete delle cellule e tratto con SDS in presenza di NaOH. in questo modo si denaturano proteine e DNA. aggiungo acetato di K che cambiando il pH fa precipitare SDS che si portaa dietro proteine e DNA genomico ( perchè quello plasmidico no?)
cmq resta il DNA plasmidico che purifico ulteriormente trattando con RNAsi e fenolo cloroformio ( ecco a questo punto mi ha interrottaa dicendo che non usavo fenolo cloroformio e ha iniziato a farmi una serie di domande che sinceraamente al momento non ricordo)
ora dal momento che questo è quello che c'è scritto sugli appunti, non solo miei, mi trovo un pò in crisi. se potessi aiutarmi  |
violetta iodice |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2009 : 18:34:09
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Citazione:
( perchè quello plasmidico no?)
perchè essendo più piccolo ha una cinetica di rinaturazione
più rapida e più efficiente, per cui non si "aggroviglia"
quando denaturi e rinaturi rapidamente e traumaticamente
(cosa che succede, invece, all'ingombrante DNA genomico) |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2009 : 18:35:41
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per quanto riguarda il primo passaggio, la separazione tra DNA genomico e DNA plasmidico avviene per due motivi, il più importante riguarda la grandezza. Il DNA genomico viene intrappolato dalla formazione delle membrane da cui non esce tanto facilmente, l'altra ragione è che nei batteri il DNA è comunque legato a proteine ed alla parete batterica, il che complica la sua mobilità e solubilità.
Hai mancato un passaggio, anche se ovvio, ovvero dopo l'acetato e la precipitazione delle membrane devi purificare il DNA plasmidico in soluzione mediante centrifugazione, così che precipiti membrane e proteine e tieni in soluzione il tuo DNA. Successivamente, è opzionale, puoi ulteriormente purificare con fenolo cloroformio che elimina altre proteine presenti in soluzione per denaturazione.
Attualmente lo si fa per le miniprep a mano, ma per le maxi, oramai da anni si usa solo il filtro che lega il DNA ad un determinato pH facendo passare le schifezze (proteine, ioni, lipidi) e poi si eluisce con una soluzione a pH diverso.
Magari voleva sapere se tu sapevi una delle due cose che ti ho scritto, purificazione e opzionalità del fenolo/cloroformio, oppure l'uso di una colonna per la purificazione.
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viodice88
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: casandrino
41 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2009 : 18:40:20
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Neuroscience non ho capito molto bene cosa ho saltato e a che punto  non è che saresti così gentile da scrivermelo più schematicamente?? te ne sarei gratissssssssima  |
violetta iodice |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2009 : 19:05:09
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1) prendi una colonia batterica e la metti in un mezzo di coltura (LB) 400-500 ml
2) li lasci crescere sotto agitazione a 37°C per 16 ore circa (il mezzo diventa torbido)
3) centrifughi i batteri e butti il mezzo (LB)
4) aggiungi acqua e zucchero + RNasi e risospendi i batteri con forza vigorosa
5) aggiungi NaOH + SDS in modo tale da lisare i batteri, saponificare e solubilizzare le membrane e contemporaneamente anche denaturare le proteine, senza agitare troppo, molto delicatamente
i batteri lisati diventeranno incolori, e la soluzione diventa filamentosa come la saliva, se non sbatti troppo il DNA genomico è bloccato tra proteine e membrane lipidiche, non sta messo molto bene, mentre quello plasmidico è più libero di circolare nella soluzione
ATTENZIONE: se in questa fase agiti troppo (Vortex) il DNA genomico si libera dalle proteine e dalle membrane frammentandosi e si andrà ad aggiungere ad i DNA plasmidici.
6) dopo massimo 5-20 minuti (dipende dal volume della soluzione, dal pH, e dalla temperatura a cui tutto questo succede) aggiungi il potassio acetato o il sodio acetato, in modo tale da riportare il pH ad un valore prossimo a 7 circa.
I fosfolipidi non sono più ionizzati per cui precipitano insieme alle proteine in una nuvola bianco/giallo intrappolando all'istante il DNA genomico, mentre quello plasmidico è ancora in soluzione
a questo punto hai una soluzione puzzolente con DNA plasmidico in soluzione e delle nuvole schifose che galleggiano
7) centrifughi alla massima velocità così che le membrane+proteine+DNA genomico+schifezze varie rimangano sul fondo, mentre il DNA plasmidico rimane in soluzione
Raccogli la soluzione e butti via le membrane
8) (OPZIONALE) purifichi con cloroformio/fenolo per denaturare ed eliminare altre proteine che ti sei portato dietro.
Questa procedura non è in uso da un bel po' di tempo, poiché non purifica bene e le tracce di fenolo contaminano gli esperimenti successivi. Questa procedura si usa solo in altri casi dove non è richiesta una particolare cura della purificazione
9) a questo punto hai DNA plasmidico in soluzione ed è diluitissimo e sporco,
quindi, la metti in una colonna (tipo cromatografia) in cui un filtro trattiene il DNA e si lascia far passare dalle altre cose... quindi lavi più volte e butti quello che esce dalla colonna.
10) hai una colonna con il tuo DNA plasmidico legato all'interno, metti una soluzione che ha un determinato pH stacca il DNA dalla colonna e lo fa uscire in soluzione... raccogli il DNA purificato ma troppo diluito (5-10-20 ml)...
11) precipiti la soluzione con un alcool (isopropanolo o alcool etilico) ed il DNA precipita, centrifighi ad altissima velocità, togli l'alcool, il DNA rimane attaccato alla provetta con un alone biancastro e semitrasparente... quando si è un po' seccato dall'alcool metti 1 ml d'acqua e si risolubilizza all'istante (si spera)
STOP
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viodice88
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: casandrino
41 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2009 : 19:14:02
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ok, questo ora è chiaro, ma la prof parlava di centrifugazione per densità, attraverso cui separava il tutto.  |
violetta iodice |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2009 : 19:40:05
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con la centrifugazione per densità si fa tutt'altro non certo una cosa quantitativa come la maxiprep.
Sei sicuro che era riferito proprio alla preparazione della maxiprep?
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2009 : 20:03:03
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Quantitativa?!  |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2009 : 20:04:22
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Forse la tua prof parlava dell'arcaica purificazione di plasmidi
su gradiente di cesio cloruro. Mi domando chi la usi ancora. |
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viodice88
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
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41 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2009 : 20:23:22
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sisi..era proprio la maxiprep!! mi sa che devo tornare da lei per delucidazioni, se non altro per sapere quello che vuole sapere  grazie cmq per l'aiuto!! |
violetta iodice |
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