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bonnie985
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 21 settembre 2009 : 15:26:49
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Ciao a tutti!
Volevo chiedervi se qualcuno di voi ha avuto esperienza con i PCR Array della SABiosciences, perchè abbiamo acquistato un kit ma abbiamo ancora qualche dubbio da risolvere prima di cominciare ad utilizzarlo, per evitare di sprecare materiale facendo troppe prove...
facendo una ricerca sul forum ho trovato solo un utente che ne parlava, ma a livello di analisi dei dati.. i miei problemi sono invece più a monte, a livello pratico, nell'allestimento del saggio.
Se ci fosse qualcuno che ha già utilizzato questi kit, avrei qualche informazione da chiedere...
grazie mille in anticipo!!
Silvia
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2009 : 19:51:47
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Guarda io li conosco anche se non ci avuto a che fare direttamente.
In ogni caso forse se ci dici qual'è il tuo problema possiamo vedere come esserti utili.
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bonnie985
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2009 : 20:48:01
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Grazie!
Allora il mio problema è che, dopo aver estratto l'RNA (con l'RNeasy mini kit della Qiagen) dai miei campioni, ho trovato delle quantità di RNA totale piuttosto basse, e quindi molto diluito nei 35 ul che si ottengono dall'estrazione.
Nel protocollo consigliano di utilizzare (soprattutto per i "first users" come dicono loro) quantità di RNA di almeno 0,5-1 ug, che però devono essere contenute al massimo in 8 ul che servono per la RT (anche se poi dicono che si può partire da un minimo di 25 ng, ma col rischio di falsi negativi sotto i 100 ng).
Abbiamo quindi pensato di concentrare i campioni, per poter utilizzare la maggiore quantità di RNA possibile in un volume di 8 ul.
Abbiamo provato prima a concentrare per precipitazione con sodio acetato, ottenendo però risultati pessimi, poichè il pellet non si vedeva e abbiamo perso molto RNA.
Volevamo provare ad usare un carrier, e ci hanno prestato un tRNA della sigma: col tRNA abbiamo concentrato molto bene (abbiamo quantificato col bioanalyzer agilent che ha quantificato solo i picchi 18S e 28S, riconoscendo i tRNA come un picco separato).
Il fatto è che non sappiamo se il tRNA possa causare interferenze sulla piastra al momento della qPCR. l'abbiamo chiesto al servizio clienti ma non ci hanno risposto in maniera molto chiara; ci hanno invece proposto di comprare una mix di preamplificazione, da usare sul cDNA dopo la RT, ma ha un costo spropositato, e soprattutto lo vendono solo insieme al kit di RT che ci hanno però già venduto precedentemente...
Tutto ciò per capire se, secondo voi, senza concentrare i campioni e senza preamplificare, caricando in RT quantità che vanno dai 60 ng in su, posso ottenere dei risultati decenti, oppure se dobbiamo andare a fare la carità alla prof per comprarci anche il kit di preamplificazione??
scusate se mi sono dilungata, spero almeno di essermi spiegata abbastanza bene..
grazie!!!
Silvia |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2009 : 00:29:24
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Sinceramente mi sembra strano che un tRNA possa interferire, comunque non si dovrebbe amplificare con i primer specifici. Magari se avete altri campioni potete provare a riprecipitarli con un carrier diverso, tipo glicogeno o acrilamide lineare.
Poi se volete preamplificare l'RNA non esiste solo il kit che ti vendono loro! Ce ne sono tantissimi e potete anche farvelo da soli, se ne parlava in questa discussione: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=12583
Sinceramente non so se con 60ng ottieni dei dati decenti, presumo di si perchè comunque dovrebbe essere una metodica molto sensibile. Ma non vorrei dartelo per certo!
Le altre opzioni te le ho dette sopra.
So che quei kit sono molto costosi e certo non si possono sprecare a fare prove.
Mi spiace più di così non so aiutarti.
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bonnie985
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2009 : 19:44:33
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grazie mille!!
valuteremo anche gli altri kit di preamplificazione.. appena ho un attimo mi leggo bene l'altra discussione!
grazie ancora!
Silvia |
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