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kk74
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
 Inserito il - 24 settembre 2009 : 23:07:10
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ciao a tutti, volevo sapere se, per disegnare dei primers, devo considerare la RefseqRNA o la CDS RNA nel programma Primer-Blast.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 00:06:46
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Scusa ma dove l'hai vista l'opzione "CDS RNA" in Primer Blast?
C'è solo "Refeq RNA", 2 genomiche e non redundant! |
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kk74
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 08:49:58
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| Si, scusami non intendevo la Refseq ma la sequenza FASTA. In realtà la CDS la puoi trovare nella pagina del gene (ENTREZ GENE) di interesse, verso la fine della pagina. Mi è capitato di scegliere dei primers dati dal programma e di cercarli nella sequenza CDS ma non li ho trovati. Confrontando la FASTA e la CDS mi sono accorta che uno dei primer si trovava prima dell'ATG nella CDS. Scusami se faccio queste riflessioni ma è da poco che mi occupo di biologia molecolare, prima facevo tutt'altro. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 09:25:37
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Premessa: FASTA è semplicemente un formato in cui viene scritta la sequenza
tutte le sequenze che utilizzi in genebank e i tools associati usano sequenze scritte in FASTA.
Tu forse intendi la sequenza intera con 5' e 3' UTR o solo la seq. codificante (CDS), beh questo dipende da che primers devi disegnare e a cosa ti servono. |
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kk74
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 10:23:43
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| devo semplicemente vedere l'espressione di un gene e al più quantificarlo |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 11:34:43
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Beh l'mRNA comunque è formato da tutta la sequenza, compreso 5' e 3' UTR, quindi va bene anche se utilizzi tutta la sequenza non solo il CDS.
Facciamo un esempio pratico per capirci:
scelgo il gene per l'actina alfa umana: ACTA1
la sequenza dell'mRNA è questa: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/47078293
dalla sequenza basta che clicchi su: Pick Primers nel "Sequence Analysis Tool" box a destra e ti si apre questa pagina:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?ORGANISM=9606&INPUT_SEQUENCE=NM_001100.3&log$=seqview_box_primer
è già tutto settato affinché ti cerchi i primers per quella sequenza.
Basta che clicchi "Get Primers" e ottieni i tuoi risultati.
Questo è il risultato: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1253867804&job_key=JSID_01_56601_130.14.22.39_9003
In realtà dovresti tener presente di alcune caratteristiche, ad es. quando si disegnano primers per una RT-PCR (N.B. non è la real time, ma la PCR da cDNA!) un accorgimento da tener presente è quello di disegnare i primers, o almeno uno dei 2 a cavallo tra 2 esoni in modo che si possa attaccare solo al cDNA e non al DNA genomico. In questo modo eviti che ti si amplifichi anche DNA, questo è importante sopratutto se fai un'analisi quantitativa, è vero che in genere se scegli primers situati in 2 esoni diversi avrai prodotti di lunghezza diversa da cDNA e da gDNA ma questo ti potrebbe comunque dare fastidio. Scegliendo un primer a cavallo tra 2 esoni eviti che questo accada.
In realtà i risultati che ti dà in questo caso per la alfa-actina sono tutti primers all'interno di un esone, non a cavallo tra 2 esoni, quindi c'è la possibilità che amplifichino anche gDNA.
A quel punto sta a te controllare i primers e vedere dove si attaccano e decidere se utilizzarli o disegnarne altri.
Nessuno ti vieta di utilizzare quei primers, molti lo fanno, se comunque tratti il tuo RNA con DNasi non dovresti avere gDNA, io personalmente preferisco evitare e disegnare i primers come ti ho detto. Poi vedi tu.
Altra cosa da tener presente, se fai una quantificazione mediante real time con SYBR Green sopratutto, il prodotto della PCR deve essere abbastanza piccolo, quindi tornando all'esempio la coppia "Primer pair 7" che dà un prodotto di 893bp la scarterei.
Spero sia abbastanza chiaro quello che ho scritto, se hai altri dubbi chiedi.
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kk74
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 11:44:02
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grazie 100000000. sei stata molto gentile.E' tutto chiaro.
ciao |
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283
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115 Messaggi |
Inserito il - 18 maggio 2012 : 09:09:35
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mi inserisco in questa discussione..perchè vorrei cortesemente chiedere se qualcuno può spiegarmi come interpretare i risultati di blast e quindi capire se posso tenere i primer. per es i risultati che mi fornisce mi indicano che il mio primer mappa con altri mRNA ma non per tutte le basi...cosa faccio? lo tengo.
grazie per l'aiuto e scusate se la domanda può sembrare stupida. |
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primers con primer-blast
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