determinare composizione amminoacidica

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Morfeo
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Città: Roma

110 Messaggi

Inserito il - 30 settembre 2009 : 09:04:16

Ciao a tutti, sto studiando tra le altre cose varie metodologie biochimiche. Ho un dubbio.
Partiamo che ho la mia proteina purificata e dosata, adesso voglio identificare la composizione dei suoi amminoacidi (e dopo stabilirò la struttura primaria con la degradazione di Edman ad esempio.) A quanto ho letto si fà un idrolizzato usando HCl 6N a 110°C per 24 ore circa. Dopo, uso la cromatografia a scambio ionico, con la fase mobile costituita da un gradiente di pH e calcolo il volume di eluzione per ogni singolo aa o il tempo di ritenzione di questo sulla fase staz e mi ricavo di quali aa ho trovato. Ecco questo è il punto, la spiegazione è che io posso risalire a quali amminoacidi ho sapendo che essi hanno dei certi valori di pKa e quindi si ripartiscono in maniera differente tra la fase mobile e quella stazionaria? ma se la fase mobile è un gradiente di pH quindi

ho qualche dubbio su come spiegarlo. Poi si intende per derivatizzazione appunto che io risalgo a quali amminoacidi ho o sbaglio. Ultima cosa, dopo la cromatografia posso quantificarli usando una reazione colometrica con la ninidrina e fare una spettrometria UV, con la ninidrina assorbiranno di più per via della natura ciclica di questa molecola penso no? e poi mi derivo la concentrazione dall'equazione di lambert-beer in pratica. Vi ringrazio se mi date una mano e scusate se mi sono dilungato troppo!!