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farmacologia
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 Inserito il - 06 ottobre 2009 : 20:34:01
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PROTOCOLLO ANALISI MUTAZIONALE JAK 2
Si amplificano 300 ng di DNA o 3 microl di cDNA ottenuti da una retrotrascrizione a partire da 1 microgr di RNA.
I primer per l’amplificazione da DNA sono:
Forward 5’ GGGTTTCCTCAGAACGTTGA 3’
Reverse 5’ TCATTGCTTTCCTTTTTCACAA 3’
I primer per l’amplificazione da cDNA sono:
Forward 5’ GTAGGAGACTACGGTCAACTG 3’
Reverse 5’ TGCATGGCCCATGCCAACT 3’
Le condizioni di PCR sono :
94° C --> 5’
94°C -->30”
63°C -->30” ----> 35 cicli
72°C -->30”
72 °C --> 7’
Il prodotto di amplificazione viene digerito con l’enzima BSA XI e se è presente la mutazione si ha un frammento di dimensione uguale all’indigerito che viene sempre messo come controllo.
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Allegato:  Corsa e Digestione Jak2.pdf
56,08 KB
I campioni che risultano positivi alla digestione vengono purificati con le colonnine e sequenziati
Questa è la metodica con l'enzima di restrizione.
io uso anche una MASA o un Kit specifico con tecnologia Taqman.
fammi sapere se sono stato chiaro. |
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Jak2
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