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valeria8
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 06 ottobre 2009 : 19:17:27
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Salve a tutti. volevo il vostro aiuto per quanto riguarda un problema che abbiamo sulle pcr.
Non riusciamo assolutamente ad amplificare il nostro gene d'interesse, le abbiamo provate tutte, dalle temperature alla durata dei cicli, formammide, dmso, varie concentrazioni di Magnesio o di dna....il risultato è sempre lo stesso...gli amplificati appaiano ( quella volta che appaiono!) con doppia banda (banda dei primer).
Ora (in realtà sin dal principio) c'è sorto il dubbio sui primers che ci fanno utilizzare...a noi sembrano eccessivamente complementari...ora vi riporto la sequenza:
Primer R
C T T C A G A G G C C C C C A G G A C T
Primer F
G A A G T C C G A G G G T G T A T G T T
cosa ve ne pare??????????
vi prego rispondeteci che siamo disperate!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
 Inserito il - 06 ottobre 2009 : 19:25:26
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secondo me ti dovresti preoccupare principalmente della grande differenza di Tm dei due oligo
A seconda dell'algolitmo che si usa, ci sono dai 5 agli 11° gradi di differenza. Veramente tanti
A che Ta fai la PCR? Hai già provato al di sotto dei 54°C ?
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valeria8
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2009 : 19:44:46
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Si abbiamo provato anche a 52°, qlche campione si amplifica ma poi cominciano a nn amplificarsi +
Ora stavamo prvando a 62°, sembrava andare bene, poi improvvisamente il nulla! |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2009 : 19:52:17
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Secondo il metodo di calcolo utilizzato le temperature degli oligo sono 54 e 62, oppure 52 e 60, in un caso addirittura 53 e 65.
Dipende ovviamente anche dalla concentrazione degli oligo, dalla conc di sali, Mg2+ etc
Però sono veramente tanti.
Una volta riuscii a fare questo tipo di PCR aumentando di molto la concentrazione di uno dei due oligo... ora non ricordo quale, però alla fine dati i risultati comunque scarsi, lasciai perdere ed accorciai una delle due sequenze.
in bocca al lupo
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2009 : 19:59:54
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Mah, io ridisignerei del tutto i primers. Sono troppo complementari...
E' la cosa più veloce da fare secondo me |
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valeria8
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2009 : 20:08:17
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beh è quello che pensiamo anche noi, e nn riusciamo a capire perkè non lo fanno...ormai sono 3 mesi che va avanti questa storia.
Ma...toglietemi un altro dubbio, perkè ridisegnare i primers da capo, quando in alcuni lavori sono riportati i primers utilizzati?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2009 : 20:16:10
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Beh, se hai altri primer pubblicati prova quelli.
Il mio punto è che se quelli che hai non funzionano, conviene cambiarli. Se poi ci sono già pubblicati o esistono a livello commerciale tanto di guadagnato, ti risparmi di fare i primers, ma sinceramente io fossi in te non starei più a cambiare le condizioni di PCR. Anche se riuscissi a farla funzionare ho paura che otterresti sempre qualcosa di non troppo "notevole". |
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valeria8
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2009 : 20:37:31
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SI, ci sono dei lavori con diverse coppie di primers utilizzate... però dato che da noi li hanno ridisegnati pensavamo che, boh forse, ha una qlche valenza in piu' disegnarseli anzicchè prendere quelli gia usati,cioè influenza il valore di una pubblicazione finale???
pultroppo queste sono decisioni che non prendiamo noi, siamo solo tesiste...
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2009 : 23:48:20
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Citazione:
ha una qlche valenza in piu' disegnarseli anzicchè prendere quelli gia usati,cioè influenza il valore di una pubblicazione finale
Su questo direi proprio di no, anche perchè oramai il processo di disegno dei primer è molto automatizzato. Alla fine quello che conta è che la PCR funzioni, dove prendi la sequenza dei primer poco importa :) |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2009 : 23:56:11
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scusatemi se insisto, ma tutta questa complementarietà io non la vedo. Se le sequenze sono scritte entrambe in direzione 5' 3' non c'é più complementarietà di tutta una serie di primers utilizzati in letteratura. Tanto é vero che non si forma un amplicone, ma semplicemente non succede nulla.
Piuttosto ci sono degli evidenti errori o forzature nel disegno dei primers.
Es la differenza di temperatura degli oligo, una % esagerata di GC, una sequenza lunghissima di GC ripetute, un amplificato di circa 200 bp. Non ho visto bene la regione genomica, ma di certo ci saranno zone più felici di quelle scelte.
Ti suggerirei
1) se cambi oligo per una pcr classica, in genere ti basta che gli oligo si appaiano solo in quella regione scelta e che l'amplificato si unico con la lunghezza prevista.
2) come dice chick80 tentare di insistere con questi oligo non vale la candela. Esperienza personale, una buona coppia di primers non ha bisogno di tante attenzioni nella formulazione del protocollo.
3) attento durante questi tentativi a non congelare e scongelare gli oligo per più di 4-5 volte. Ad un certo punto non funzioneranno più per motivi diversi dal protocollo, nella mia esperienza ho notato che molte persone disperate in cerca di un protocollo di pcr perché gli .
3) se puoi, fai pcr >300 bp, eviti confusioni con prodotti aspecifici determinati dai primers, ed eviti una facile denaturazione con sparizione di bande amplificate.
In bocca al lupo
n. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 ottobre 2009 : 00:27:53
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Beh comunque c'è una buona complementarietà, anche se concordo che non è il problema maggiore.
Mia massima pigrizia, per non fare disegnini allego l'immagine di un progamma di analisi di primers:
Neuroscience, forse non te ne sei accorto, ma manca un pezzo al punto tre!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 07 ottobre 2009 : 00:53:24
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ops... già, é vero, chiedo venia.
Ho ricevuto una telefonata metre correggevo la mia bozza e poi ho dimenticato di finirla.
Tuttavia credo che sia prevedibile cosa volesi dire, oltre che probabilmente inutile ai fini dell'aiuto richiesto.
n. |
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