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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
 Inserito il - 08 ottobre 2009 : 09:07:00
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Vi pongo una ennesima questione: Utilizzo dei gel di acrilammide al 12,5% di 20 cm, facendoli correre a 10 mA. Le prime volte la corsa durava intorno alle 24 ore, ottenendo una buona risoluzione delle proteine. Ora vedo che dopo 20 ore il campione ha corso pochissimo, meno della metà del gel stesso. Secondo voi è normale?
Quanto fate durare in media una corsa? Io in letteratura ho letto che per gel lunghi la corsa dura over night.
Garzie a tutti per l'aiuto
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2009 : 20:47:21
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Salve memole.
Partendo dal presupposto ke non ho mai fatto gel da 20 cm di lunghezza  ... so dalla letteratura che per gel molto lunghi la corsa può durare o.n.
In ogni caso una variazione così consistente nel tempo di corsa del gel è sospettosa, soprattutto se nn hai variato alcuna condizione!
Io rifarei le soluzioni con cui prepari il gel e il buffer di corsa (i Tris HCl e la tris glicina). Magari a lungo andare si concentrano i sali al loro interno... ed hanno diverso pH da quello ke dovrebbero avere. D'altra parte in questi casi dovresti avere anche una peggior risoluzione del gel.
Il secondo indiziato a mio avviso è l'alimentatore utilizzato per settare il voltaggio della corsa o, più spesso, il coperchio o i cavetti dell'apparato di corsa. In questi casi basta provare cambiando alimentatore o cavetti.
Buona fortuna. Fammi sapere come risolvi! 
P.S. Mia curiosità: che tipo di campioni vannocorsi su gel da 20cm o.n.? |
Ascoltami con gli occhi... |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2009 : 19:53:29
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aaaaah i gel lunghi!!!
per i gel lunghi a 14 mA (o meglio 7 mA per gel) la corsa dura taaaaantissimo! figurati che a volte la mando ON e al mattino dopo i campioni sono ancora a metà gel! 
ho notato però che usando sempre running fresco (lo so che ce ne vogliono litri e litri in questo caso!) la corsa è un po' più veloce. se le proteine migrano bene, quindi, non spaventarti per la durata.
@gst: sui gel lunghi vengono caricati gli stessi campioni che si usano per quelli piccoli, con la differenza che la lunghezza del gel permette una migliore separazione della proteine, utilissima nel caso in cui, ad esempio, vuoi verificare gli interattori di una particolare proteina che hai precipitato e fai il sequenziamento direttamente dal gel (in pratica eviti la sovrapposizione di bande che hanno + o - lo stesso PM). |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 27 ottobre 2009 : 18:45:00
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Ciao a tutti e due!!!
Colorando il gel col silver staining mi sono accorta che il campione era vecchio (cosa che già sospettavo visto che lo avevo preparato diversi mesi fa, e poi è stato scongelato più volte per problemi al -80) per cui ho deciso di buttare tutto. Non potendo preparare del campione fresco perchè mancavano una serie di reagenti (ennesimo imprevisto in questo mio periodo di tesi decisamente sfigato ) ho contattato i tecnici biorad che mi hanno proposto due differenti alternative:
- una corsa over night a 1500 Vhr
- una corsa con una prima mezz'ora a 16mA e poi 5-7 ore a 24 mA.
Col mio collega stiamo pensando di adottare la seconda alternativa. In ogni caso la prossima settimana parto con l'esperimento (questa è dedicata all'isolamento del campione) e poi vi farò sapere. Grazie mille ad entrambi per le risposte.
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 27 ottobre 2009 : 18:49:22
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| @ Gst scusami prima non ti ho scritto che campioni sono. Sto lavorando con linfociti umani estratti da sangue periferico, stiamo cercando di capire se nelle nostre condizioni sperimentali ci sono variazioni nel proteoma. |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 27 ottobre 2009 : 20:27:27
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Grazie a entrambi per la chiarezza!
Un'ultima curiosità se posso -.- il motivo per cui è necessario correre ad amperaggio così basso? per nn far surriscaldare il gel? e perchè nn c'èlo stesso probl cn i gel piccolini?
Inoltre.. per il trasferimento (blotting) di un gel di qsto tipo, come si procede? ameperaggio, tempi, buffer...
Grazie ancora! |
Ascoltami con gli occhi... |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 28 ottobre 2009 : 14:20:08
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l'amperaggio credo che si mantenga così basso per problemi di surriscaldamento, come dici tu, che non ci sono in un gel piccolo dato che la durata della corsa del campione dipende da quanto è lungo un gel, quindi gel più lungo, corsa più lunga e maggiore riscaldamento. invece per il trasferimento si procede esattamente come per un gel piccolo, quindi stesso buffer (ma in quantità industriale ), a 400mA per 4 ore.
@memole: ho riguardato il mio quaderno e ho letto che la corsa ON la mandiamo a 7 mA per gel (quindi 14 per due gel) e il giorno dopo alziamo l'amperaggio fino ad un max di 40 mA (sempre per gel).
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 29 ottobre 2009 : 09:28:14
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Grazie per le dritte Iside. Proverò prima a fare una corsa come mi hanno consigliato loro e se no dovessi ottenere risultati soddisfacenti farò riferimento a quello che mi hai consigliato. In ogni caso ti terrò aggiornata!!!
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Durata corsa elettroforetica
Didattica e Relazioni
