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Vanilla Sky
Utente Junior
204 Messaggi |
 Inserito il - 10 ottobre 2009 : 23:03:10
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Ciao ragazzi, vi vorrei chiedere se mi potreste spiegare qual’è la differenza tra southern blot e western blot ( presto dovrò affrontare l’esame di biologia molecolare…).
Non credo sia sufficiente spiegare che:
il western blot è una tecnica che permette di identificare una determinata proteina in una miscela di proteine, mediante il riconoscimento da parte di anticorpi specifici, in cui la miscela di proteine viene prima separata in base al loro peso molecolare tramite SDS page utilizzando un gel di poliacrilammide (o dot blot); successivamente le proteine vengono trasferite su una membrana di nitrocellulosa e si procede al riconoscimento della proteina mediante l'utilizzo di un anticorpo specifico. La membrana può essere sondata con soluzioni di anticorpi. Gli anticorpi che legano specificamente la proteina di interesse possono essere visualizzati con tecniche diverse, tra cui prodotti colorati, chemioluminescenza o autoradiografia.
Il southern blot serve a sondare la presenza di specifiche sequenze di DNA in un campione di DNA: i campioni, prima e dopo una digestione con enzimi di restrizione sono separati tramite elettroforesi su gel. Nel gel sarà possibile osservare uno smear, ossia una striscia continua. Il gel viene immerso in una soluzione alcalina per denaturare il DNA, solitamente utilizzando una soluzione di NaOH diluita.Alla fine il gel è trasferito su una membrana sfruttando il fenomeno della capillarità. Il foglio di nitrocellulosa viene separato dal gel e immerso in una soluzione contenente una sonda marcata in vario modo (fluorescenza, radioattività) che ibridizza con sequenze di DNA complementari presenti sul foglio. Dopo si effettua un lavaggio della nitrocellulosa per eliminare le sonde non ibridate, si fa una lastra fotografica per evidenziare il punto in cui la sonda ha legato il dna genomico.
Grazie per l’aiuto!!!
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
 Inserito il - 11 ottobre 2009 : 00:13:41
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Le principali differenze sono già ben evidenti da quello che hai scritto:
come vedi è diverso il tipo di analita (proteine vs. DNA) ed è diversa la
procedura tecnica di trasferimento (elettrotrasferimento nel WB vs.
passaggio per capillarità nel SB).
Se ti serve sapere altro ci sono un sacco di discussioni a riguardo sul forum!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2009 : 21:32:09
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Un paio di precisazioni:
Citazione:
in cui la miscela di proteine viene prima separata in base al loro peso molecolare tramite SDS page utilizzando un gel di poliacrilammide (o dot blot)
(a parte che PAGE si scrive maiuscolo ed è un acronimo per PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, ma questo è un punto minore)
Il dot blot è un'altra cosa! Non separi le molecole in base al peso molecolare ma semplicemente le spotti direttamente su una membrana. In realtà per le proteine non l'ho mai sentito, in genere si usa per il DNA.
Blot è il termine inglese per il "trasferimento" e il blot lo fai anche dopo l'SDS PAGE.
Quindi al massimo puoi dire che fai un SDS-PAGE e successivo blot oppure un dot blot, ma non che separi le molecole in base al peso con un dot blot!
(comunque io personalmente nel Westren Blot non parlerei proprio di Dot Blot)
Citazione:
è diversa la procedura tecnica di trasferimento (elettrotrasferimento nel WB vs. passaggio per capillarità nel SB).
ok diciamo che in genere è così, ma non è vero in assoluto anche per il Southern si può utilizzare l'elettroblot, ne parlavamo in questa discussione: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=12435
Le due differenze fondamentali rimangono quindi e diverse molecole utilizzate e il metodo con cui vengono analizzate anticorpo/sonda.
Poi va benissimo che tu descriva le tecniche.
Come diceva Dionysos se cerchi trovi moltissime discussioni in proposito.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2009 : 23:00:43
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Citazione:
In realtà per le proteine non l'ho mai sentito, in genere si usa per il DNA.
Sì, lo puoi fare anche per le proteine. Non usatissimo, ma l'ho visto qualche volta |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2009 : 23:21:52
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Ah ok, immaginavo si potesse fare, ma non l'avevo mai sentito e sinceramente non ne vedo tantissimo il senso, comunque buono a sapersi.  |
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Vanilla Sky
Utente Junior
204 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2009 : 10:35:23
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Grazie ragazzi per i vostri chiarimenti che sono stati utilissimi!
Non mancherò di documentarmi ulteriormente sulle altre discussioni in proposito! |
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:) Differenze Southern e Western Blot
Didattica
