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elia
Nuovo Arrivato
Prov.: sassari
Città: sassari
5 Messaggi |
 Inserito il - 21 ottobre 2009 : 17:00:15
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ciao a tutti, non è che qualcuno potrebbe spiegarmi che differenza c'è tra una pcr-rflp e una pcr-aplp? e quando uso una metodica e quando l'altra?
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2009 : 17:49:24
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Credo tu intenda AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) non APLP (che comunque esiste e sarebbe: Amplified Product Length Polymorphism)
Comunque per dirla in due parole (per evidenziare le differenze)
la PCR-RFLP è una normale PCR alla quale fa seguito la RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), amplifichi una zona di DNA dove sai essere presente un polimorfismo che altera un sito di restrizione e poi tagli con quello specifico enzima di restrizione, analizzando i frammenti su gel vedrai dei pattern caratteristici: un frammento più lungo se l'enzima non taglia e 2 frammenti più corti se l'enzima taglia.
La AFLP-PCR (anche detta semplicemente AFLP) tecnicamente è il contrario, tagli tutto il DNA con un enzima di restrizione e poi fai la PCR.
Una volta tagliato il DNA con un certo enzima di restrizione leghi ai frammenti degli adattatori, i primer della PCR saranno costruiti su questi adattatori e dopo l'amplificazione analizzi i frammenti ottenuti.
La differenza dell'utilizzo è che la PCR-RFLP ti serve per analizzare polimorfismi noti, uno alla volta, mentre con la AFLP analizzi contemporaneamente vari polimorfismi presenti nel genoma.
Puoi leggerti qualcosa sulle due tecniche su wikipedia:
RFLP
RFLP (italiano)
AFLP
oppure cercarti anche qualche altra discussione sul forum, tipo queste:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=377
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1114
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1003
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elia
Nuovo Arrivato
Prov.: sassari
Città: sassari
5 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2009 : 18:04:07
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Credo tu intenda AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) non APLP (che comunque esiste e sarebbe: Amplified Product Length Polymorphism)
Comunque per dirla in due parole (per evidenziare le differenze)
la PCR-RFLP è una normale PCR alla quale fa seguito la RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), amplifichi una zona di DNA dove sai essere presente un polimorfismo che altera un sito di restrizione e poi tagli con quello specifico enzima di restrizione, analizzando i frammenti su gel vedrai dei pattern caratteristici: un frammento più lungo se l'enzima non taglia e 2 frammenti più corti se l'enzima taglia.
La AFLP-PCR (anche detta semplicemente AFLP) tecnicamente è il contrario, tagli tutto il DNA con un enzima di restrizione e poi fai la PCR.
Una volta tagliato il DNA con un certo enzima di restrizione leghi ai frammenti degli adattatori, i primer della PCR saranno costruiti su questi adattatori e dopo l'amplificazione analizzi i frammenti ottenuti.
La differenza dell'utilizzo è che la PCR-RFLP ti serve per analizzare polimorfismi noti, uno alla volta, mentre con la AFLP analizzi contemporaneamente vari polimorfismi presenti nel genoma.
Puoi leggerti qualcosa sulle due tecniche su wikipedia:
RFLP
RFLP (italiano)
AFLP
oppure cercarti anche qualche altra discussione sul forum, tipo queste:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=377
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1114
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1003
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elia
Nuovo Arrivato
Prov.: sassari
Città: sassari
5 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2009 : 18:07:26
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| ciao, grazie per la risp cmq io intendevo proprio aplp.... in pratica, da ciò che ho capito, con questa tecnica non vengono proprio utilizzati gli enzimi di restrizione, si fa direttamente correre il prodotto di pcr su gel di acrilammide |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2009 : 20:40:10
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ah ok, scusa pensavo fosse l'AFLP perché è più comunemente messo in relazione con l'RFLP.
Comunque per quanto riguarda invece l'APLP (Amplified Product Length Polymorphism), appunto come dice il nome ti permette di identificare un polimorfirsmo grazie alla lunghezza del frammento amplificato, questo è l'articolo originale:
Amplified product length polymorphism (APLP): a novel strategy for genotyping the ABO blood group.
(se non puoi accedere al full text dimmelo che te lo mando)
comunque nell'articolo trovi anche una bella immagine che lo spiega.
Ti faccio una spiegazione semplificata considerando solo 2 alleli:
-si utilizzano dei primer che sono in grado di evidenziare diversi polimorfismi in quanto sono specifici per ogni polimorfismo
ad es. hai questo polimorfismo A/C e avrai 2 primer diversi uno che riconosce A e l'altro C, per fare questo sono diversi al 3' una avrà A e l'altro C, quindi in sostanza così:
Allele 1 Allele 2
_________A__________ _________C__________
_________T__________ _________G__________
_________A__________ _________C__________
<---- <---- Primer Reverse
-----A -----C
_________T__________ _________G__________
Primer F1 Primer F2
quindi solo col primer F1 amplificherai l'allele 1 e solo col primer F2 si amplificherà invece l'allele 2, però così non sarebbero distinguibili su gel perchè avrebbero la stessa lunghezza, quindi la strategia utilizzata è quella di aggiungere delle code non complementari di diversa lunghezza al 5' dei primer in modo che l'amplificato risulti di diversa lunghezza.
Quindi una cosa di questo tipo:
Allele 1 Allele 2
_________A__________ _________C__________
_________T__________ _________G__________
_________A__________ _________C__________
<---- <---- Primer Reverse
___
\-----A \-----C
_________T__________ _________G__________
Primer F1 Primer F2
e i frammenti quindi li puoi riconoscere in base alla grandezza facendoli migrare su gel di polyacrilamide:
------------C-----
------------------
------A-----
------------
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2009 : 15:58:32
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Rispondo anche alla domanda:
Citazione:
quando uso una metodica e quando l'altra?
In realtà su questo non saprei darti una risposta precisa, la PCR-RFLP viene molto utilizzata mentre la APLP non è stata utilizzata moltissimo dalla sua invenzione, ci sono veramente pochi articoli in proposito.
Con le 2 tecniche alla fine fai più o meno la stessa cosa, anche se con una dopo la PCR digerisci con ER mentre con l'altra basta fare la PCR.
La RFLP è più lunga, perché devi prima amplificare e poi digerire, mentre la APLP è più corta, hai risultati in minor tempo, ma credo che il disegno dei primers sia un pochino più complicato quindi richiede maggior tempo in fase di settaggio.
Poi come utilizzo sono interscambiabili, puoi utilizzare una piuttosto che l'altra.
La APLP è stata inventata per la discriminazione allelica del gruppo AB0 e viene utilizzata essenzialmente per questo e per discriminare aplotipi nel DNA mitocondriale (questo guardando gli articoli presenti in PubMed), ma potrebbe benissimo essere utilizzata in qualunque caso si utilizzi da PCR-RFLP.
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elia
Nuovo Arrivato
Prov.: sassari
Città: sassari
5 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2009 : 16:25:10
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ciao, è veramente una cosa strana, io sto analizzando il polimorfismo al locus E nella specie bovina che di fatto ha 4 alleli principali tre dei quali vengono analizzati con la rflp e uno con la aplp... e io non riesco a capire il motivo... grazie tante cmq |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2009 : 16:37:32
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Non saprei dirti nulla del caso specifico, ma probabilmente è solo perché sono stati messi a punto quei sistemi.
Magari semplicemente mai nessuno ha provato a disegnare dei primers per APLP dei polimorfismi che vengono analizzati mediante RFLP o magari ci hanno provato e non hanno ottenuto dei buoni risultati.
Come ti dicevo il disegno dei primers per APLP è più complicato che non quello per una PCR normale (sulla quale poi puoi fare una RFLP), quindi può darsi che il motivo sia semplicemente questo.
Ah dimenticavo una cosa fondamentale che non ho mai detto in questa discussione, è banale ma forse è il caso di specificarla.
È vero che i polimorfismi che si analizzano mediante RFLP possono in teoria essere analizzati anche mediante APLP, ma non è vero il contrario!
Se un polimorfismo altera un sito di restrizione per un enzima allora puoi fare una RFLP, ma ovviamente se questo polimorfismo non altera alcun sito di restrizione non puoi, devi utilizzare qualche altro metodo.
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elia
Nuovo Arrivato
Prov.: sassari
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5 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2009 : 16:52:24
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| ok grazie tante... |
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PCR
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