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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
 Inserito il - 31 ottobre 2009 : 11:38:08
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Salve a tutti ragazzi!
Vi pongo una questione curiosa a mio avviso.
Mi è capitato di correre estratti proteici di campioni di tessuto murino sano e campioni di tessuto murino tumorale. Gli estratti sono stati quantificati tutti insieme e posti nello stesso gel, e da ponceau SEMBRAVANO abbastanza bilanciati.
Faccendo il blotting per l'actina per verificare che i campioni fossero in quantità uguali, ho notato ke tutti i tessuti tumorali avevano maggior actina. Ho messo poi la tubulina ed ho ottenuto lo stesso risultato.
Precedentemente era successa la stessa cosa ad una mia collega con campioni tumorali e sani quantificati indipendentemente da me. Lei aveva addiruttura ri-quantificato i campioni e ricorsi, ottenendo sempre maggiore actina nei campioni tumorali.
Allora ho cercato qualche articolo e ho visto ke in letteratura non usano actina o tubulina per normalizzare tessuti tumorali rispetto a sani. Ad esempio in un articolo usano la proteina Ran!
Potrebbe essere che quindi i campioni non sono sbilanciati, bensì devo usare un altro normalizzatore?
Help -.-
Thank you
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 31 ottobre 2009 : 14:02:44
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Sicuramente non userei proteine del citoscheletro come standard in campioni tumorali perchè saranno sicuramente overespresse rispetto ai controlli.
Non conosco Ran, ma se è usata in letteratura può essere un buon punto di partenza. |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2009 : 14:33:23
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| GAPDH? |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2009 : 13:05:12
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Grazie chick80!
Per quanto riguarda GAPDH, invece, ci avevo pensato, ma nn mi sembra una buona idea: i tessuti tumorali sono caratterizzati da un maggiore uptake del glucosio rispetto al tessuto circostante... e l'espressione della proteina GAPDH è regolata in base al metabolismo del glucosio se nn erro. Per questo l'avevo scartata! D'altra prte non ho l'anticorpo per la proteina ran, quindi dovrei trovare un'alternativa! al + presto...
Si accettano suggerimenti...
Grazie per la'aiuto!  |
Ascoltami con gli occhi... |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 02 novembre 2009 : 14:03:47
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Non sono sicuro che GAPDH abbia le caratteristiche di un
enzima "inducibile" in base alla conc. di glucosio, perchè
mi è sempre stato dipinto come l'archetipo dell'enzima costitutivo.
Controllerò |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
 Inserito il - 05 novembre 2009 : 19:14:11
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Grazie1000 GFPina  spulcio subito tutto quello ke mi hai segnalato!
In ogni caso, su consiglio di altri, ho "ricaricato" gli stessi campioni sulla base dell'actina del gel precedente (tramite rapporti densitometrici)!
Qsta volta ovviamente le actine sono bilanciate! Ma mi rimane il dubbio che in realtà i campioni erano bilanciati prima, ma nn lo sembravano perchè i tumori hanno + actina!  |
Ascoltami con gli occhi... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2009 : 20:04:37
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Citazione:
Qsta volta ovviamente le actine sono bilanciate! Ma mi rimane il dubbio che in realtà i campioni erano bilanciati prima, ma nn lo sembravano perchè i tumori hanno + actina!
hmmm.... no infatti io non mi fiderei di quei risultati, rischi di vedere (o meno) altre differenze sui tuoi geni di interesse quando non ce ne sono... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2009 : 23:59:17
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Concordo assolutamente con chick! Non mi fiderei affatto di quei risultati. Se noti che nei campioni con la stessa quantità totale di proteina l'actina è diversa evidentemente è perchè cambia e non è un buon housekeeping, calibrare comunque i campioni rispetto all'actina significa semplicemente "falsare" i risultati.
Anzi ti dirò che avendo avuto anch'io parecchi problemi a trovare housekeeping validi per ho visto molti articoli dove addirittura anziché utilizzare un housekeeping colorano il gel o la membrana con Coomassie per dimostrare che la quantità totale delle proteine è la stessa, e a mio modesto parere è una buona cosa!
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 07 novembre 2009 : 08:31:15
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Grazie a entrambi! Quella di prendere l'immag del ponceau è un'ottimo suggerimento, grazie GFPina!
Mi era passato per la mente, d'altra parte pensavo ke, dato ke la colorazione ponceau è meno sensibile del WB, fosse un modo meno preciso di paragonare i campioni. Inoltre, i tessuti sani e tumorali hanno pattern di bandeggio davvero molto diversi! Se si guardano alcune bande intense sono isocaricati! D'altra parte, ci sono anche bande con diverse intensità.
Come avrete capito... nn è semplice 
Grazie ancora per l'aiuto! |
Ascoltami con gli occhi... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 07 novembre 2009 : 10:07:17
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Citazione:
Mi era passato per la mente, d'altra parte pensavo ke, dato ke la colorazione ponceau è meno sensibile del WB, fosse un modo meno preciso di paragonare i campioni.
Può essere meno sensibile ma a mio avviso in questo caso è più preciso.
Citazione:
Inoltre, i tessuti sani e tumorali hanno pattern di bandeggio davvero molto diversi! Se si guardano alcune bande intense sono isocaricati! D'altra parte, ci sono anche bande con diverse intensità.
Prova a misurare l'intensità totale (lo puoi fare con imageJ ad es.) |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 novembre 2009 : 13:05:39
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Si comunque attenzione, io ho detto Coomassie non Ponceau!
Il Ponceau non è molto sensibile e ti serve giusto per farti un'idea veloce dopo il blotting, ma per valutare la quantità totale di proteine io consiglierei il Coomassie che è di sicuro più sensibile.
Poi è normale che tu veda delle bande più intense in un caso e altre nell'altro caso, altrimenti non avrebbe senso!
Comunque se fai una quantificazione e carichi la stessa quantità e poi vedi le intensità delle bande totali (buona idea quella di misurare l'intensità totale come dice chick) dovresti essere abbastanza sicura.
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 09 novembre 2009 : 20:33:18
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GFPina, avevo capito che tu intedevi Comassie, ma il problema è ke se coloro con comassie poi nn posso fare il Wb, qndi non posso considerarlo come quantità di campione caricato sul wb, perchè sono gel diversi!
Giustissimo il suggerimento di misurare le bando totali in ogni caso! nn ci avevo pensato 
GRAZIE!
Ma scusate l'ignoranza, ke programma è imageJ?  dove potrei scaricarlo?
Grazie ancora per l'aiuto! |
Ascoltami con gli occhi... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 09 novembre 2009 : 22:01:04
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Citazione:
Messaggio inserito da Gst
GFPina, avevo capito che tu intedevi Comassie, ma il problema è ke se coloro con comassie poi nn posso fare il Wb, qndi non posso considerarlo come quantità di campione caricato sul wb, perchè sono gel diversi!
Beh io in realtà coloro le membrane con Coomassie quando ho finito il WB, in realtà c'è un metodo per decolorare le membrane colorate con Coomassie per poi farci il WB, ne ho sentito molto parlare ma non ho mai conosciuto di persona nessuno che l'abbia fatto in prima persona, ne tanto meno l'ho fatto io! Mi hanno sempre detto che sanno che si fa o l'hanno visto fare. C'era anche una discussione con la ricetta, ma dovrei cercarla.
Comunque puoi sempre (se hai abbastanza campione) seminare 2 gel con lo stesso quantitativo e colorarne uno e blottare l'altro (o blottarli entrambi e colorarne solo uno) per avere un'idea del caricamento, cosa che in realtà puoi fare anche con Ponceau.
Comunque poi puoi colorare la membrana dopo il western e normalizzare con quella.
P.S. piccola nota si scrive Coomassie con 2 "o" e si pronuncia "Cumassi", ma tranquilla lo sbagliano tutti!  |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 10 novembre 2009 : 20:56:04
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AHHHHHHHHHHHHH  nn sapevo si potesse colorare con Coomassie una membrana dopo aver fatto il Wb! Credevo si potesse fare solo per i gel  (mia mancanza!).
Anche se nn l'ho mai fatto immagino si proceda come per il gel!
Avevo pensato, inoltre, all'ipotesi di fare 2 gel e caricarne uno blottare l'altro... ma in qsto modo non puoi escludere che su uno dei 2, per errore, hai caricato diverso volume di un qualke campione. Forse sono esagerata, ma secondo me è meno corretto rispetto all'ipotesi di colorare la stessa membrana su cui rivelo le proteine di mio interesse.
Grazie GFPina e chick80: consigli sempre preziosi.
P.S. "COOmassie"... è vero! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 10 novembre 2009 : 21:15:49
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Citazione:
Avevo pensato, inoltre, all'ipotesi di fare 2 gel e caricarne uno blottare l'altro... ma in qsto modo non puoi escludere che su uno dei 2, per errore, hai caricato diverso volume di un qualke campione. Forse sono esagerata, ma secondo me è meno corretto rispetto all'ipotesi di colorare la stessa membrana su cui rivelo le proteine di mio interesse.
Si sicuramente è meno corretto! Ma ti dà un'idea.
La metodica per la colorazione delle membrane è un pochettino diversa da quella del gel, non ricordo se l'ho inserita in qualche discussione, ma magari ne approfitto per recuperarla e aggiungerla ai protocolli!
EDIT: protocollo aggiunto!
Eccolo: http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=70 |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 12 novembre 2009 : 19:26:22
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Beh aggiungo anche questa informazione visto che io e la tecnica finlandese ci stiamo divertendo a sperimentare nuovi protocolli, mentre tutti sono già andati a casa da un pezzo!!!
Abbiamo fatto una prova colorando una membrana di PVDF con BioSafe Coomassie (Bio-Rad) che normalmente utilizziamo per i gel e nonostante lasci un po' di background le bande sono visibili meglio rispetto al Ponceau (che ovviamente avevamo provato poco prima). Anche in questo caso però per vedere le bande è necessario far asciugare bene la membrana.
Poi accidentalmente abbiamo scoperto che questa colorazione è completamente reversibile!
La tecnica che stava preparando un'altra membrana per il trasferimento ha accidentalmente rovesciato il metanolo e un po' è finito sulla nostra membrana decolorandola. Così l'abbiamo immersa tutta in metanolo e abbiamo scoperto che viene completamente decolorata! 
Non appena possibile proveremo a farci un western e vedremo i risultati! |
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Discussione |
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Controllo di caricamento di campioni tumorali
Didattica e Relazioni
