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Vanilla Sky
Utente Junior
204 Messaggi |
 Inserito il - 02 novembre 2009 : 14:50:36
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Perdonatemi per la domanda banale, ma purtroppo non ho ancora colto pienamente il senso e l’utilità dei linker e degli adattatori..
Ho già dato uno sguardo alle discussioni che trattavano questo argomento.
I linkers sono corti oligonucleotidi sintetici autocomplementari che contengono, al loro interno, un sito di restrizione. Per esempio la sequenza:
5'-CCGGATCCGG-3'
Esso contiene al suo interno il sito di riconoscimento per BamHI.
In presenza di un frammento “blunt” SmaI e di ligasi avremo, se non sbaglio, un frammento che ha un sito BamHI a ciascuna estremità.
Poi se tratto questo frammento con l’enzima BamHI trasformo un’estremità blunt (SmaI) in una sticky (BamHI).
Purtroppo non riesco a capire come mai si debbano fare tutti questi passaggi per avere come prodotto finale, se non sbaglio, un’estremità coesiva..perdonatemi per la domanda stupida!!
Non riesco a capire ugualmente il senso degli adapters che sono però coppie di brevi oligonucleotidi sintetici parzialmente complementari progettati per appaiarsi tra loro creando un frammento a doppia elica con estremità coesive differenti. Alla fine del processo di legazione con SmaI, per quale utilità mi devo ritrovare con un frammento che ha estremità coesive BamHI?
Vi ringrazio in anticipo!!!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 02 novembre 2009 : 15:02:13
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Beh le motivazioni variano anche da caso a caso, ad es. banalmente hai un vettore che contiene un sito di restrizione per BamHI, lo tagli con questo enzima e per ligarci dentro un frammento bisogna che anche questo abbia l'estremità che contenga la sequenza di BamHI in modo da essere complementare a quella del vettore e legarsi.
In linea generale si potrebbe anche dire che:
- un clonaggio sticky è più facile e più efficiente di uno blunt
- è direzionale (in realtà devi avere 2 estremità diverse affinché lo sia)
In ogni caso se devi ligare un frammento in un vettore e non hai estremità complementari devi in qualche modo renderle complementari affinché la ligazione avvenga e quindi utilizzi linkers e adattatori.
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Vanilla Sky
Utente Junior
204 Messaggi |
 Inserito il - 02 novembre 2009 : 15:08:18
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Grazie 1000 GFPina, sei stata chiarissima!
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STEFANIApcr
Nuovo Arrivato
Prov.: Brescia
Città: Brescia
26 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2012 : 10:25:09
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Ragazzi, scusate se sto per porgere una domanda analoga, ma non capisco in quali circostanze uso un adapter e in quali uso un linker, se entrambi i tipi di molecole sintetiche possono servire per creare estremità adesive a partire da estremità piatte.
Grazie per la pazienza!! |
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