| Autore |
Discussione |
|
|
kk74
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
 Inserito il - 11 novembre 2009 : 15:30:44
|
|
ciao a tutti. mi sta succedendo una cosa strana:ho dei primers che mi stanno amplificando qualsiasi cDNA io metta nella mix (e non dovrebbe essere così perchè sono specifici per un certo antigene) ma il "bianco" (mix senza cDNA)è negativo. Che vuol dire? sono inquinati o no? Please help me!
|
|
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 11 novembre 2009 : 16:30:58
|
Scusa???
Non mi è affatto chiaro quello che dici!
Che cDNA metti?
In teoria nel cDNA tu hai una mix di cDNA diversi derivanti dai diversi RNA presenti nel tuo campione, quindi se è presente il tuo RNA quello si amplificherà!
Gli unici casi in cui questo potrebbe essere anomalo sono:
- fai una retrotrascrizione (retrotrascrizione non PCR!) con un primer gene-specifico per il gene X e quindi hai il cDNA solo di quel gene, quindi ti si può amplificare in PCR solo se utilizzi primers per il gene X. Se hai un cDNA specifico invece per Y e usi primers di PCR per X non ti si deve amplificare!
In questo caso se hai amplificazione e se i primers possono amplificare anche DNA genomico puoi pensare ad una contaminazione da DNA genomico.
- utilizzi cDNA da specie diverse, in cui la sequenza dove si attaccano i tuoi primer è diversa e quindi dovresti ottenere amplificazione solo nel cDNA della specie "giusta"
Però forse è il caso che ci spieghi meglio cosa fai, come retrotrascrivi e che differenza c'è tra i tuoi cDNA.
Piccola nota:
Citazione:
perchè sono specifici per un certo antigene
casomai sono specifici per un certo gene, l'antigene non c'entra!
Antigene
Antigen |
 |
|
|
kk74
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
Inserito il - 11 novembre 2009 : 19:44:17
|
| in pratica faccio una RT classica:da RNA totale ottengo poi cDNA.il problema è che questi primers hanno sempre funzionato bene. mi davano positività nelle linee cellulari del tessuto specifico di mio interesse e invece non amplificavano nulla nelle altre linee cellulari derivanti da altri tessuti, che mi portavo come controlli negativi. Questi stessi cDNA, a distanza di due mesi, conservati a -20°C, ora sono diventati positivi, cioè i primers in questione amplificano "qualcosa" che è della stessa lunghezza dell'amplificato specifico. ho controllato la seq. dei primers e non ci sono aspecifici della stessa lunghezza nè contaminazioni di DNA danno lo stesso risultato. in questo modo viene spontaneo pensare che i primers siono inquinati con qualche cDNA, però perchè quando nella PCR faccio il cosiddetto bianco, quest'ultimo non amplifica niente? se i primers sono inquinati non dovrebbe venire positivo? E' un rompicapo lo so, e non so come spiegarmelo nè come spiegarlo a voi... |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 12 novembre 2009 : 01:16:19
|
Beh a questo punto allora penserei che ad essere inquinati sono i cDNA ci controllo.
Come dici tu se avessi inquinamento nei primers avresti amplificato anche nel controllo negativo (senza cDNA)
Prova a riestrarre l'RNA da qualche tessuto negativo e a rifare il c-DNA. |
|
|
| |
Discussione |
|
RT-PCR
Didattica
