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Messaggio inserito da Sepsi

Ciao a tutti,

il problema che vi sottopogo è il seguente: ho delle cellule HeLA dalle quali voglio ottenere un estratto nucleare, un estratto citoplasmatico e, da questo, riuscire a purificare le membrane tra cui il reticolo endoplasmatico (quindi riuscire ad osservare per w.blot il segnale del marcatore GRP94 nella lane corrispondente al pellet dell’ultracentrifugato del citosol).
Io riesco a purificare in maniera ottimale il nucleo e il citosol (ciò lo confermo con un w.blot per una proteina che è solo nucleare e che vedo solo nella lane del nucleo) ma dal citosol non riesco poi a buttar giù le membrane!

Io prendo l’estratto citoplasmatico e lo ultracentrifugo per 1 ora, a 4°, a 50000 rpm; separo il surnatante dal pellet e quest’ultimo lo risospendo in un buffer composto da 50 mM Tris HCL pH 7.5, 250 mM di KCl, 0.5% di Triton X 10%, inibitori proteasi 1/100.

Infine analizzo per w.blot con un anti-grp94 (proteina presente sul reticolo endoplasmatico) ma niente segnale nel pellet (il segnale è presente nel surnatante)

Ho provato anche aggiungendo all’estratto citoplasmatico, prima dell’ultracentrifugazione, saccarosio alla concentrazione di 0.25 M (secondo un mio collega dovrebbe facilitare la purificazione), ma il risultato è stato lo stesso.


Bene, se qualcuno ha un protocollo migliore o qualche consiglio lo accetto volentieri, così nel caso decidessi di ripetere l’esperimento utilizzerò queste dritte. Grazie mille!

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