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jeje
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
 Inserito il - 16 dicembre 2009 : 17:11:13
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ciao le mie avventure cn i blot continuano..
ultimamente trasferendo le proteine a 270 mA a RT mi ritrovo una sorta di puntini sopra alla membrana e sotto le bande..
lo vedo con il pounceau e poi al momento dello sviluppo..
cos'č????
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jeje
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2009 : 17:15:07
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scusate forse non mi sono spiegata bene..
i puntini sono sopra alle bande, come a creare una nube..non ridete di me per favore.
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bioda
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 18 dicembre 2009 : 11:34:58
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Ciao
non ho la mimima idea di cosa possano essere i tuoi puntini. 
Non sono un esperto in WB ma prova a fare il transfer a 30 volts Over NIght a 4°C.
Wish you luck
Davide
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Iside
Utente Attivo
Cittą: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 18 dicembre 2009 : 14:56:38
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jeje penso che nessuno stia ridendo di te...
io sinceramente non ho nemmeno capito che problema hai, perchč non provi a postare una foto? |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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domi84
Moderatore
Cittą: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 21 dicembre 2009 : 10:30:16
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Citazione:
270 mA a RT mi ritrovo una sorta di puntini sopra alla membrana e sotto le bande
Quanto tempo fai il blot? A me perņ sembra un po' alta come quantitą di corrente. Dovresti raffreddare il blot. Potrebbe dipendere da quello. Oppure potrebbe dipendere dall'anticorpo primario/secondario (č una nuova stock?), potresti (una volta diluito nel latte) filtrarlo con un filtro 0,45...pare aiuti a disaggregare gli Ab se hanno formato "grumi"... |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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jeje
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 21 dicembre 2009 : 17:56:53
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il blot buffer lo raffreddo sempre...perņ con questo amperaggio si surrisacalda..potrebbe essere quello il motivo..
farei o/n ma la proteina č di 65kDa percui un o/N non č troppo???che dite? |
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domi84
Moderatore
Cittą: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 21 dicembre 2009 : 18:51:51
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Usi PVDF o Nitrocellulosa? Io comunque facevo sempre il trasferimento ON. Non capisco cosa centri il peso della proteina?
Lo facevo a 35/40 mA ON in camera fredda. |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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Dionysos
Moderatore
Cittą: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 21 dicembre 2009 : 20:49:17
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Secondo me 270 mA vanno benissimo, ma per un trasferimento
che non duri pił di tre o quattro ore. Se lo fai overnight č troppo.
Il fatto che si surriscaldi č normalissimo: io uso
una lastra di ghiaccio per tenere refrigerate le
membrane (oppure un pacchetto pieno di ghiaccini)
I puntini li trovi subito dopo il trasferimento?
gią sul ponceau? sono macchiette chiare?
se sģ, potrebbe trattarsi di bolle - e allora devi
stare attento quando prepari il sandwich, a schiacciarlo
bene in ogni punto - oppure di sali - e allora devi
lavare meglio le spugne che usi per il sandwich (in H20dd) |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontą e della libertą
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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lą
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 22 dicembre 2009 : 14:19:55
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| io faccio il trasferimento a R/T con un ghiaccino per raffreddare il buffer a 110 volts e al masimo dell'amperaggio per 1 ora che mi consente lo strumento, e uso una membrana di nitrocellulosa 0.45 µm |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Cittą: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 22 dicembre 2009 : 19:17:38
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jeje... io ho capito di cosa parli  č successo anche a me e nn ho capito bene quale fosse la cusa, ad ogni modo io ho riolto stando molto attenta a alcune cose:
-bagnare sempre molto bene le spugnette mentre si monta il trasferimento
-essere ciura che tra il gel e la carta (no membrana eh... la carta 3 millimetri) non ci siano delle piccolissime bollicine. In tal caso qlle te le ritroveresti da ponceau.
-essere sicura che il blotting buffer nn sia vecchio e sopratt che le quantitą dei diversi reagenti siano precise
Ad ogni modo, io blotto a 300 mM, ma con buffer freddo, ghiaccioletto e inoltre in camera fredda!
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Ascoltami con gli occhi... |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 22 dicembre 2009 : 21:57:35
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| a me č capitato un paio di volte, non so di preciso perchč, ma ho risolto ripreparando l'acrilammide. forse c'era del contaminante o dei sali precipitati! |
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Western Blot problematica
Didattica e Relazioni
