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Jackal
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: Palermo
1 Messaggi |
 Inserito il - 22 aprile 2004 : 22:47:46
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Ho seri problemi con il Western Blot... o mi riesce sporchissimo o bianco totale  e per quanto ci riprovi ho sempre risultati insoddisfacenti, credo che il mio protocollo non sia proprio il massimo... CERCO PROTOCOLLI, possibilmente su campioni derivati da sangue, da testare con anti mouse.. o anti rabbit..  grazie a tutti coloro che mi saranno di aiuto
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Karonte |
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atreliu
Amministratore
Prov.: Milano
Città: Milano
2484 Messaggi |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 23 aprile 2004 : 19:21:19
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Il protocollo è molto da "personalizzare" a seconda delle proteine che stai cercando e degli anticorpi che usi.
Se hai lastre molto sporche probabilmente è un problema di bloccaggio, se invece sono molto nere, o l'anticorpo non è il massimo... oppure potrebbe essere necessario incubare per meno tempo o con diluizioni più alte di anticorpo.
Ti posso comunque dire il protocollo che uso io:
Dopo aver estratto le proteine (non uso campioni di sangue, quindi non so aiutarti in questo) ed averle quantificate, prendi un'opportuna quantità di campione, in modo da caricare per tutti la stessa quantità di proteine. Io in media carico dai 20 ai 50 microgrammi di proteina, a seconda di quanto è specifico l'anticorpo e di quanto è espressa la proteina in analisi.
Aggiungo al campione buffer 4x riducente:
- H20 sterile -> 6.0ml
- Tris-HCl 0.5M pH 6.8 -> 2.0ml
- glicerolo -> 3.2ml
- SDS 10% -> 3.2ml
- beta-mercaptoetanolo -> 0.8ml
- 0.05% (w/v in H2O) blu di bromofenolo -> 0.8ml
Per calcolare la quantità di buffer da aggiungere dividi il volume di campione per 3.33 (in modo che sia 1/4 sul volume totale ottenuto)
A questo punto carichi il gel, lo fai correre e trasferisci su nitrocellulosa.
Il buffer di corsa che uso è (da diluire 1 a 5 prima dell'uso):
- Tris base -> 30.3g
- Glicina -> 144g
- SDS 10% -> 100ml
Portare a 2l con H2O milliQ
Il pH dovrebbe essere 8.3 (eventualmente pHare)
Il buffer di trasferimento, invece è:
- Glicina -> 14.64g
- Tris base -> 29.04 g
- SDS 10% -> 18.5 ml
Portare a 800ml con H2O milliQ
Il pH dovrebbe essere 8.3
Al momento dell'uso diluire 160 ml di questo buffer con 200 ml di metanolo e 600 di H2O.
Il trasferimento va fatto a 4°C a 30V costanti o/n o alternativamente 60V costanti per 2-3 ore.
Dopo il trasferimento, sciacquare la membrana con TBS-Tween (30ml NaCl 5M, 6.66ml Tris 1.5M, portare a 1l con H2O. Aggiungere 1ml di Tween 20).
A questo punto devi fare il bloccaggio, che può essere fatto in albumina di siero bovino 5% o in latte sempre 5% (da sciogliere in TBS-Tween, anche se alcuni protocolli consigliano PBS-Tween 1%).
La scelta tra albumina e latte dipende dall'anticorpo: in generale il latte è consigliato per i policlonali, ma non è sempre detto.
Nota che il bloccaggio è una fase critica, e ti può eliminare molto sporco nella lastra finale. Il bloccaggio può essere fatto per + o meno tempo a seconda di quanto è specifico l'anticorpo che usi dopo. A me è capitato di usare un anticorpo x una proteina fosforilata, così specifico che bastavano 30' di bloccaggio. Se l'anticorpo non è un gran che ti consiglio un bloccaggio o/n a 4°C.
Dopo il bloccaggio sciacqua la membrana con TBS-Tween (altri protocolli fanno i lavaggi con H2O, ma sinceramente secondo me è meglio il TBS-T) e poi metti l'anticorpo primario.
L'anticorpo primario può essere messo o/n a 4°C o 1-2h a temperatura ambiente. A questo punto togli l'anticorpo e sciacqua 2-3 volte per 5-10' la membrana con TBS-T per togliere l'eccesso di ab non legato.
Metti l'anticorpo secondario per 1h a T ambiente.
Sciacqua 2-3 volte per 5'.
Rileva il segnale!
Nota che le concentrazioni degli anticorpi possono variare molto a seconda della specificità. Di solito io uso diluizioni da 1:1000 a 1:10000. E' importante, inoltre, durante incubazione e lavaggi, mettere la membrana su un dondolino, in modo da distribuire bene il liquido su tutta la superficie.
Spero di esserti stato d'aiuto.
Ciao
nICO |
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lachensi
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 15 maggio 2008 : 11:17:04
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Per quel che mi riguarda confermo quello detto sopra ad eccezione del traseferimento fatto a 250mA amperaggio costante.
Le proteine sono bloccate sulla membrana dall'MeOH presente nel buffer di trasferimento il latte serve per saturare e non per bloccare, in questo modo si evitano numerosi aspecifici.
Grazie
Buon lavoro |
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Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 15 maggio 2008 : 11:50:23
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anche io seguo il proocollo di chick80, ma come lachensi faccio il trasferimento ad amperaggio costante intorno ai 300mA per 1 ora con il tampone freddo (conservo il tampone in camera fredda fino al suo utilizzo e ho l'accortezza di aggiungere il MetOH appena prima dell'uso e durante il trasferimento cambio il ghiaccino ogni mezz'ora).
Per la saturazione ho sempre usato il TBS-T con 5% latte, e utilizzo sempre TBS-T-latte per diluire l'anticorpo (sia primario che secondario).
Se hai lastre molto sporche ti consiglio di lavare per almeno 45 minuti-1 ora dopo il secondario cambiando il lavaggio ogni 5-10 minuti prima di sviluppare.
L'altra cosa che ti consiglio è quella di colorare il filtro con Rosso Ponceau subito dopo il trasferimento, almeno sei sicuro che le proteine ci siano, che siano corse bene, che non ci siano bolle...sai a volte uno fa tutto, arriva alla fine e non vede nulla, magari c'era una bolla proprio all'altezza della proteina che ti interessava.
Se ti interessa:
-smonti il sandwich del trasferimento e metti il filtro in una scatolina,
-aggiungi la soluzione di colorante e vedrai che immediatamente si colorano tutte le proteine di rosa e vedi subito se c'è qualcosa che non va,
-rimuovi il colorante(che puoi riutilizzare un sacco di volte purchè lo conservi al riparo dalla luce
- lavi il filtro velocemente con un po' di acqua milliQ per ridurre il background
-(io poi metto il filtro tra un foglio di pellicola e faccio una fotocopia, ma è uno scrupolo mio)
-metti in PBS per decolorare (ci vogliono 2 minuti)
-procedi con il protocollo standard
A livello di tempo colorare con il Ponceau ti porta via meno di 10 minuti, ma è utilissimo, almeno se è successo qualcosa durante il trasferimento non butti anticorpi e soprattutto tempo inutilmente.
ciao |
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Rosycotton
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2008 : 16:04:15
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Carissimo/a! Sappi che ti sono moralmente vicina! Mi è successa la stessa identica cosa durante la scorsa estate...
Se non hai già risolto il tuo problema ti suggerisco (dall'alto della mia ignoranza) di fare una cosa mooolto banale: controlla sempre che le vaschette che usi per le incubazioni delle membrane siano molto ben pulite e risciacquate con acqua distillata prima di utilizzarle...
Sembrerà una cavolata ma da quando lo faccio i western mi sono sempre riusciti!
Oppure controlla sempre anche il pH di tutte le soluzioni... Non si sa mai... Saluti!!! |
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vega
Nuovo Arrivato
Prov.: catania
Città: catania
8 Messaggi |
Inserito il - 27 maggio 2008 : 12:42:03
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sono molto d'accordo con rosycotton per quel che riguarda la "pulizia".....
ma cmq nel lab dove lavoro è stato necessario estrarre proteine e quindi wb da campioni di sangue. il problema potrebbe nn essere nella tecnica ma nell'estrazione.....
1. lisare le cellule in Laemli buffer
2. sonicare
3. nn dosare (normalizzare inizialmente per n.ro di cellule)
4. decidere la q.tà da caricare (ad es. 50ul)
5. denaturare ed aggiungere blu di bromofenolo allo 0.5%
6. wb.....il trasferimento è stato fatto a 500mA per 2h in frigo.
Prova....e fammi sapere! |
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vega
Nuovo Arrivato
Prov.: catania
Città: catania
8 Messaggi |
Inserito il - 27 maggio 2008 : 12:49:00
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inoltre alla fine del trasferimento, colora con red ponceau....almeno nn perdi tempo dopo: se nn si vede nulla inutile sprecare anticorpi!
il MeOH nel buffer di trasferimento nn lo aggiungo all'ultimo, perchè lo farebbe "riscaldare", lo preparo durante la corsa elettroforetica: 3 g Trizma Base, 14.4 g Glicina, 200 ml Metanolo, H2O (portare a volume di 1 litro) e conservare a 4°C fino al suo utilizzo.
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 27 maggio 2008 : 14:57:23
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Citazione:
Messaggio inserito da vega
inoltre alla fine del trasferimento, colora con red ponceau....almeno nn perdi tempo dopo: se nn si vede nulla inutile sprecare anticorpi!
personalmente, sconsiglio la colorazione con ponceau, il perchè l'ho detto quì: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=3058
Naturalmente se hai dei dubbi sul trasferimento o sopetti che il western sia venuto male la colorazione con Ponceau ci sta tutta! |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Western Blot
Didattica e Relazioni
