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starkeeper
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1 Messaggi |
 Inserito il - 22 gennaio 2010 : 15:48:42
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Ciao a tutti. Ho parecchi problemi a far venire le ligasi, sia lineari che di frammenti su plasmidi (talvolta per quelle su plasmide ci vogliono anche 3-4 tentativi, per quelle lineari di solito è più facile). Volevo sapere se qualcuno di voi che ne fa tante ha qualche suggerimento da dare. :) Queste ligasi fanno perdere un sacco di tempo se si lavora molto di ingegneria genetica!
Grazie mille.
Tesista in microbiologia a Tor Vergata
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2010 : 17:56:09
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1) verifica l'attività della ligasi, magari fai una prova con un altro lotto o un'altra marca
la tua ligasi potrebbe essere, per qualche motivo, inquinata o meno attiva, es parecchi congelamenti/scongelamenti possono deteriorare l'ATP del buffer o della ligasi se è una master mix.
2) verifica le condizioni di ligazione, se metti il buffer giusto, se ci sono problemi di inquinamento, se è necessario più tempo, oppure una temperatura diversa da quelle che normalmente utilizzate.
3) verifica se gli enzimi di restrizione che usi vanno in sovradigestione, spesso gli enzimi di restrizione lasciati per molto tempo a digerire, o usati in eccesso, o con il buffer sbagliato, oppure se reagisce con altri enzimi non compatibili, o se le condizioni non sono ideali possono deteriorare l'estremità 5' o 3' dei filamenti tagliati rendendoli difficili da rilegare... verifica su un catalogo o su qualche sito quanto dovrebbe essere la % di ri-ligation del tuo enzima di restrizione.
Verificate queste considerazioni banali, poi pensare a cose un po' più complesse
in bocca al lupo
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Problemi con le ligasi
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