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Californication
Nuovo Arrivato

3 Messaggi

Inserito il - 27 gennaio 2010 : 22:09:10

ciao ragazzi....avrei un probelma da risolvere

sto eseguendo in laboratorio la tecnica western blot usando membrane in PVDF.
Dopo il trasferimento (200mA costante per 45 minuti) ho ottenuto un risultato particolare, ovvero la membrana in PVDF era diventata trasparente (come se si fosse corrosa) quasi del tutto solo ove il gel era a contatto con essa.
Per errore non avevo eseguito l'attivazione della membrana in metanolo 100%...pu� essere dovuto a questo???

Per curiosit� mia ho portato avanti la procedura con la membrana (seppure rovinata)quindi ho incubato questa con l'anticorpo ecc. e ho visto che si era ricostituita (praticamente non era pi� trasparente).
Infine sviluppandola con un kit per reazione cromogenica con perossidasi ho ottenuto come risultato delle bande e delle crepe solo in corrispondenza delle lane in cui ho caricato i miei campioni.

Qualcuno di voi sa darmi dei chiarimenti???...grazie mille

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 27 gennaio 2010 : 23:42:43

Beh � fondamentale attivare le membrane di PVDF in metanolo!
Serve per rendere la membrana che � idrofobica un po' pi� "idrofilica" e quindi stare meglio in soluzione.
Probabilmente il contatto diretto con il gel non le ha fatto molto piacere, non so esattamente che reazione sia avvenuta. Per� se il tuo buffer di trasferimento contiene metanolo ha agito un po' quello e delle proteine sono state trasferite ugualmente, ma la parte a diretto contatto con il gel (almeno sul lato dove c'era il gel) � stata meno a contatto diretto col metanolo.

Non ho capito il risultato, le bande sono quelle giusto della proteina riconosciuta dall'anticorpo?
Le crepe sinceramente non saprei cosa siano.

Californication
Nuovo Arrivato

3 Messaggi

Inserito il - 28 gennaio 2010 : 21:33:36

ciao...le bande sono all'altezza giusta della mia proteina le crepe ho visto oggi che forse sono dovute al tempo in cui eseguo il lavaggio della membrana prima dello sviluppo.Circa l'attivazione della membrana purtroppo l'ho scoperto solo dopo aver fatto il western. Eppure ho scaricato il manuale dell'azienda che le produce e sul loro protocollo non era scritto.

Grazie mille per aver risposto. Spero venga decentemente stavolta.

Californication
Nuovo Arrivato

3 Messaggi

Inserito il - 28 gennaio 2010 : 21:40:47

dimenticavo...quanto tempo la lasci in metanolo al 100% la membrana per attivarla???

grazie ancora...

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 29 gennaio 2010 : 19:40:36

Io la lascio molto poco, comunque tutti consigliano da 15 sec. a 1min.

Poi io la metto direttamente nel tampone di trasferimento, c'� anche chi la lava bene in acqua distillata prima.

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