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pillina
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 31 gennaio 2010 : 17:16:19
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ciao a tutti, avrei qualche domanda di chiarimento su western blot :
1 come fanno le proteine ad attacarsi alla membrana di nitrocellulosa?
2 a cosa serve il transfer buffer?
3 a cosa serve incubare con il latte dopo il trasferimento?
grazie a tutti
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prossima biologa
Utente Attivo
1437 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2010 : 17:20:32
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ti so rispondere solo alla seconda domanda, la prima è teorica e se prendi il libro sicuramente trovi la risposta ma io non mi ricordo.
la terza è una pratica che si fa in laboratorio, ma io non ne ho mai avuto a che fare e quindi non so.
per la seconda invece è molto semplice: il buffer è una soluzione tampone.il nome stesso indica che è la soluzione che permette il trasferimento dal gel al filtro della molecola in esame, nel caso del western sono le proteine, nel caso del southern il DNA e nel caso del northern è l'RNA. |
Aiuto in biochimica?guarda qui
Info sul lavoro di biologo?guarda qui |
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pillina
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2010 : 17:25:35
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| ti ringrazio, ma è proprio perchè non trovo questo info sul libro che le scrivo qua! non riesco a capire con quale principio il buffer permette il trasferimenti delle proteina! nè perchè le stesse possono attaccarsi alla membrana, so che lei è porosa e probabilmente carica. |
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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco
262 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2010 : 18:36:34
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1)è un legame di natura chimica che dipende dalla natura della membrana che può essere non solo in nitrocellulosa ma anche in pdvf per esempio
2)la soluzione di trasferimento serve per favorire la migrazione delle proteine dal gel alla membrana e contiene SDS e metanolo
3)il latte (o la BSA) serve a saturare la membrana. Infatti le proteine contenute nel latte o la BSA stessa saturano la membrana occupando tutti i siti liberi su di essa. In questo modo l'anticorpo primario (essendo anch'esso una proteina) si legherà alla membrana solo se lega in realtà la proteina d'interesse contro la quale è diretto. Se non si saturasse la membrana invece il risultato finale sarebbe che l'anticopo andrebbe a legarsi a tutti i siti liberi su di essa e non vedresti un segnale dovuto alla tua proteina d'interesse. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2010 : 20:14:50
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1) le proteine si legano alla nitrocellulosa mediante interazione elettrostatiche, al PVDF mediante interazioni idrofobiche
2) come detto serve per far trasferire le proteine dal gel alla membrana e funzione essenzialmente come il buffer di elettroforsei, cioè passaggio di ioni
in genere contiene metanolo (che però può anche non essere messo) e in genere non contiene SDS (che però si può mettere)
per spiegazioni più precise ti rimando qui: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=6747
3) va bene quello che ha detto paolo865, aggiungo solo che questo passaggio viene definito "blocco" |
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Western Blot
Didattica e Relazioni
