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apke
Nuovo Arrivato
Città: lecce
9 Messaggi |
 Inserito il - 02 febbraio 2010 : 10:50:16
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ciao ragazzi! qualcuno sa dirmi qualcosa riguardo il far western? posso spottare le mie proteine esca direttamente sulla membrana o sono necessari gel e trasferimento?? la seconda proteina nn rischia di legarsi anch'essa alla membrana ed essere comunque rilevata dall'anticorpo??
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 02 febbraio 2010 : 13:04:21
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Citazione:
posso spottare le mie proteine esca direttamente sulla membrana o sono necessari gel e trasferimento??
 mmm innanzitutto non è la proteina esca che viene messa sulla membrana ma solo le "prede", poi la proteina esca viene messa in un secondo momento e si lega ad una delle proteine presenti sulla membrana.
Tu parti inizialmente da un lisato (mix di proteine), non avrebbe senso metterlo direttamente sulla membrana perchè avresti tutte le proteine nello stesso punto, ma è necessario separarle e quindi si fa elettroforesi (in genere non denaturante), poi si trasferisce sulla membrana e in seguito si incuba la membrana con la proteina esca che andrà a legarsi alla proteina preda (se c'è interazione)
Citazione:
la seconda proteina nn rischia di legarsi anch'essa alla membrana ed essere comunque rilevata dall'anticorpo??
anche questo non ha molto senso, non so cosa intendi per "seconda proteina" comunque la proteina preda è sulla membrana, la proteina esca si attacca alla preda e l'anticorpo lega la proteina esca. |
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apke
Nuovo Arrivato
Città: lecce
9 Messaggi |
Inserito il - 06 febbraio 2010 : 08:13:18
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no, allora scusa, ti spiego meglio... io non parto da un mix di proteine, ma da una singola proteina che ho già purificato tramite colonna cromatografica Ni-Nta e questa sarà la mia proteina preda, che il mio capo mi ha detto di spottare direttamente sulla membrana e fare successiva incubazione con la proteina esca (che era quella che intendevo come seconda proteina, perchè tra preda ed esca mi confondo!) per vedere poi se c'è interazione tra le due, visto che con il Pull Down nn riusciamo ad avere risultati da più di un mese e non riesco a capire perchè!!
 
comunque dopo aver provato così ho incubato sia con l'ab contro la proteina esca che con l'ab contro la proteina preda... e il risultato non è stato molto chiaro...
ora ho ripetuto il pull Down, ma a quanto pare le mie proteine rimangono nelle beads... non riesco ad eluirleeeeeee!!!! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 febbraio 2010 : 15:36:33
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Ah ok non avevo capito che era un esperimento che avevi fatto!
Non ho mai spottato una proteina direttamente sulla membrana, penso si possa fare, ma non saprei darti ulteriori dettagli.
Ma dopo averla spottata hai provato, senza incubarla con la proteina "sonda" ad incubare semplicemente la membrana con l'anticorpo contro la proteina esca (quella che hai spottato) per assicurarti che sia lì?
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