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Discussione

neurodue
Nuovo Arrivato

5 Messaggi

Inserito il - 04 febbraio 2010 : 20:36:14

ciao a tutti!

mi sono appena iscritta!! e ho bisogno di voi!

spero di ricevere un aiuto!

avrei una domanda da porvi... riguardo quantitative real time RT-PCR...

ho piccole quantit� di RNA (ordine di ng) che non posso quantificare in quanto la concentrazione � bassa e devo fare una RT. non sapendo da quanto RNA parto per ogni campione e considerato che posso avere quantit� diverse di RNA per ciascuno di loro, posso dire di avere una stessa efficienza di retrotrascrizione... partendo da piccole quantit� di RNA... ?? e poi fare la real time e normalizzare per uno/due house keeping senza pormi il problema di avere cDNA diverso per ogni campione... e quindi comparare i diversi campioni tra loro? in teoria con poco RNA, l'RT dovrebbe funzionarmi bene... mi aspetterei il contrario con tanto RNA... (???)...

con il kit che uso so che sono nel range di quantit� di RNA per avere una buona efficienza di retrotrascrizione... anche per piccoli geni o rna...

grazie!!

michy2
Nuovo Arrivato

44 Messaggi

Inserito il - 09 febbraio 2010 : 14:29:10

no credo che tu debba quantificarlo soprattutto se devi fare gene expression...per fare una real time che ti dia risultati attendibili devi partire da uguali quantita di RNA...se hai piccole qiantit� puoi usare il nanodrop, uno strumento che ti permette di usare un solo microlitro di RNA

cami
Utente Junior

Citt�: roma

136 Messaggi

Inserito il - 24 febbraio 2010 : 17:39:41

personalmente credo che la real time fatta in questo modo non sia molto attendibile... � vero che per fare una comparazione tra campioni fai prima il D/DCt tra gene e normalizzatore, quindi se tu usi quantit� diverse di cDNA per fare la qPCR, dovresti avere diversi livelli di espressione per il normalizzatore, per� � anche vero che tra campioni diversi (ad es. diversi tessuti, diverse linee cellulari...) non puoi sapere a che livelli viene espresso il tuo normalizzatore, e quindi a quel punto non sapresti pi� a cosa imputare le differenze che vedi...