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MARYANGY
Nuovo Arrivato
85 Messaggi |
 Inserito il - 25 febbraio 2010 : 20:26:54
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salve ragazzi... stavo studiando le sonde per la real time... x quanto riguarda le altre sonde (taqman,fret etc..) ho capito che l'intensità del segnale di fluorescenza in un certo senso è direttamente proporzionale alla quantità di dna amplificato... invece per le molecular beacons non è cosi vero? perchè esse non vengono idrolizzate, quindi a cosa è direttamente proporzionale la quantità di dna amplificato? anche perchè da una parte ho letto che "la fluorescenza prodotta dipende dalla quantità di prodotto specifico in quel dato momento" cosa vuol dire? spero che riusciate a chiarirmi questo dubbio... grazie in anticipo!
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
 Inserito il - 26 febbraio 2010 : 11:26:06
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diciamo che in real time l'intensità di fluorescenza è SEMPRE proporzionale alla quantità di DNA amplificato, quello che cambia è solo il funzionamento delle sonde... nel caso delle molecular beacons, si ha una sonda fatta a forma di forcina: le estremità dell'oligonucleotide sono complementari tra loro e sono marcate con un reporter (ad un'estremità) e un quencher (sull'altra), mentre invece la parte centrale (cioè il loop) è complementare ad una sequenza presente all'interno dell'amplicone. quando la sonda è libera, le estremità si appaiano tra loro, quindi la fluorescenza del reporter è repressa dal quencher, mentre invece quando la parte centrale della sonda si appaia al DNA (durante la fase di annealing), le estremità si allonanano e quindi si ha fluorescenza.. la differenza rispetto a Taq-man è che mentra Taqman è una sonda che non emette fluorescenza quando appaia al DNA, bensì quando si stacca (durante la fase di allungamento, dato che la sonda viene scalzata dalla polimerasi), nelle molecular beacons succede il contrario, però il principio del rapporto fluorescenza emessa/quantità di DNA amplificato è lo stesso..
in sostanza, tu all'inizio della reazione avrai una certa quantità di sonda (parliamo di molecular beacons), e poichè il DNA è poco, la fluorescenza sarà poca, perchè solo una parte delle sonde che hai messo potrà appaiarsi, mentre col progredire della reazione, aumenta la quantità di DNA, e più sonde potranno appaiarsi, quindi avrai più fluorescenza...
l'altro discorso invece, quello sull'idrolisi, dipende semplicemente da questo diverso modo di funzionare delle sonde: la fluorescenza della Taqman è repressa quando la sonda è legata al DNA, perciò per avere emissione si dovrà staccare e dovrà essere idrolizzata, per separare quencher e reporter, mentre nelle molecular beacons la fluorescenza viene emessa quando si ha appaiamento sonda-DNA, e quindi la sonda non deve essere idrolizzata: se questo avvenisse, i vari quencher e reporter sarebbero liberi in soluzione, e avresti un sacco di fluorescenza indipendentemente dalla quantità di DNA amplificato...
spero di essere stata abbastanza chiara... |
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MARYANGY
Nuovo Arrivato
85 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2010 : 15:33:24
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| si si cami ora mi è molto più chiaro... grazie mille! |
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