PCR e specificità dei primer

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purplerock1987
Nuovo Arrivato

71 Messaggi

Inserito il - 26 febbraio 2010 : 12:06:30

PErchè i primer, per una buona PCR, non devono superare una lunghezza di 18-24 bp e non devono contenere più del 40/60% di G e C?

Grazie a tutti!

cami
Utente Junior

Città: roma

136 Messaggi

Inserito il - 26 febbraio 2010 : 12:44:24

la lunghezza dei primers influenza la loro specificità, per cui ad esempio al di sotto dei 16 nucleotidi, aumenta molto il rischio di appaiamenti aspecifici. per contro, più lungo è il primer, maggiore è la specificità, però aumenta anche il rischio di formazione di dimeri di primers, loop, forcine, etc.
comunque quello che devi considerare principalmente è che la lunghezza e la composizione in basi del primer influenzano la sua temperatura di melting, perciò se utilizzi primers troppo lunghi o con una percentuale di GC troppo alta, rischi che abbiano Tm molto alte, e questo diminuisce di molto l'efficienza della polimerasi. una lunghezza dei primers compresa tra 18 e 28 nt, con una % di GC compresa tra 50 e 60% in genere ti garantiscono una Tm compresa tra 50 e 80°C (considera anche la formuletta, molto semplificata, Tm = 4 ( G+C ) + 2 ( A + T ), che vale per primers di circa 20 nt), oltre i quali la Taq non è più molto funzionale (sia perchè funziona male, sia perchè diminuisce di molto la sua emivita, e quindi la tua reazione potrà durare di meno, con conseguente diminuzione del prodotto finale..)