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Sofiris
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 Inserito il - 01 marzo 2010 : 14:08:19
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Ciao, spero qualcuno possa illuminarmi sul meccanismo d'azione della L-metionina Y-liasi(E.C.4.4.1.11) nella sintesi di amminoacidi,L-omocisteine S-sostituite.
Grazie
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livi
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2 Messaggi |
 Inserito il - 30 marzo 2010 : 18:08:14
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ho bisogno di una mano per quanto riguarda la purificazione di proteine...si tratta di un compito di metodologie biochimiche...mi si chiede di isolare una proteina transmembrana che funge da recettore, di 400kDa. Si hanno delle cellule in coltura da cui partire. Si chiede quali tecniche sia possibile usare per ottenere u quantitativo sufficiente per studiarne la funzione e purificare il ligando...e poi una volta ottenuta la proteina pura come determinarne la sequenza amminoacidica...
Dunque per gli step iniziali credo di esserci, cioè intanto stacco le cellule dalla coltura, le risospendo, aggiungo bs3, molecola in grado di dare crosslinking tra proteine che interagiscono tra loro (così posso isolarmi il recettore legato al ligando senza perdere il ligando), poi liso le cellule con tamponi ad es per lo shock osmotico (essendoci molti metodi di lisi secondo voi ce n'è altri preferibili?) e poi lisate le cellule faccio centrifugazione differenziale e isolo il pellet relativo alle proteine di membrana. A questo punto penso che dovrei solubilizzare le proteine di membrana con detergenti non ionici per mantenerne la funzione, e adesso mi resta da isolare il recettore legato al ligando... Correggetemi se ho sbagliato qualche step...Qui sorge il problema, pensavo di poter fare una cromatografia a esclusione molecolare conoscendo il PM ma se cmq io ho usato bs3 il recettore è legato al ligando quindi non peserà solo 400 kDa...quindi che faccio?una cromatografia per affinità con un altro recettore o un anticorpo? Pensavo pure una volta che avevo isolato recettore e ligando di potere fare con un'aliquota del mio campione una SDS PAGE in condiz riducenti per isolare le bande relative al recettore (che è la banda di 400kDa) e al ligando (che è l'altra)e da quella del recettore potere fare spettrometria di massa per il sequenziamento. Non capisco cmq come devo isolare SOLO i recettori legati a ligando...l'unica idea resta la cromatografia per affinità, ma nn sono convinta...
Scusate la lunghezza, spero qualcuno possa aiutarmi.. |
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