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Raffa
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 26 giugno 2006 : 15:09:32
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Ciao a tutti,sono Raffa.
E' la prima volta che scrivo....
Ho un problema enorme...Sto cercando di amplificare un frammento del genoma di HIV di circa 3100 pb,ma non riesco ad ottenere niente!Solo amplificazione di primers!!!Qualcuno saprebbe aiutarmi?!
Che parametri di pcr posso usare?E la concentrazione di magnesio?
Grazie
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 26 giugno 2006 : 18:43:07
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Innanzitutto benvenuto sul forum. 
Ci sono diverse cose di cui tener conto.
Prova a usare Tannealing un po' piu bassa, oppure primer un po' piu' lunghi.
Potresti anche provare ad aumentare un po' i tempi di annealing e di amplificazione.
Per quanto riguarda il Mg++ vai io starei attorno a 1.5-2 mM, magari alzalo un po' (puoi salire a step di 0.25 mM)
Domanda ovvia: sei sicuro di avere il gene di interesse nel campione di partenza? |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 26 giugno 2006 : 19:20:01
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Beh, per amplificare frammenti cosi' lunghi penso tu debba usare una high fidelity polymerase! Vedi Fusion o Pfu!
La Taq normale da sola non basta in questi casi!
Io per amplificare 3.7 kb uso un mix di Taq e Pfu (di questa ne uso 0.2 ul in 5 reazioni!!) e 4 minuti di extention time!
In bocca al lupo!
Ciao ciao |
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Raffa
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 27 giugno 2006 : 10:33:57
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Grazie!Seguirò il consiglio!
Poi vi farò sapere come è andata!!!!
Grazie ancora |
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sere85
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: monterenzio
29 Messaggi |
Inserito il - 17 aprile 2007 : 18:30:15
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ciao ragazzi,ho appena iniziato il tirocinio della triennale di biologia!! ANCHE IO HO DEI PROBLEMI CON LA PCR.
il laboratorio in cui svolgo il tirocinio si occupa di filogenesi degli artropodi,con particolare riferimento al barcoding. Pultroppo durante i primi tentativi non siamo riusciti ad amplificare il genoma estratto...(2Kb) so che potrebbe essere un problema della taq polimerasi, ma i potenti mezzi dell'università sono scarsi e non vogliono sostituire la taq. cosa si potrebbe fare per aumentare l'efficienza del processo oltre a trovare dei primer più specifici? grazie mille
p.s abbiamo già provato a diminuire la temperatura di annealing... |
Soltanto chi non ha approfondito nulla può avere delle convinzioni.
Emil Cioran |
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 18 aprile 2007 : 17:37:10
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X valia:
Vorrei chiederti alcune informazioni, dato che anche io lavoro con target lunghi: che pfu usi? (promega, stratagene etc..)? che rapporto taq/pfu (in termini di unità)? per la pcr usi il buffer taq o quello della pfu?
Grazie mille |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 18 aprile 2007 : 18:28:09
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Allora, è passato un po' ti tempo... Sinceramente non ricordo che Pfu era  , so che usavo il buffer normale (*), ma aggiungevo 0.3 ul di tris Base 2 M in 50 ul di reazione. Sempre in 50 ul usavo 1 ul di Taq (5 U/ul) e 0.2 ul Pfu (2.5 U/ul).
Avevo anche provato la Phusion, ma non è mai andata a buon fine......
Fammi sapere se hai altre domande!
(*) Per buffer "normale" intendavamo il 11.1X PCR magic buffer di Alec Jeffreys, posso darti la ricetta se vuoi, ma penso tu possa usare qualsiasi buffer per Taq PCR.
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 18 aprile 2007 : 19:15:37
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[Per buffer "normale" intendavamo il 11.1X PCR magic buffer di Alec Jeffreys, posso darti la ricetta se vuoi, ma penso tu possa usare qualsiasi buffer per Taq PCR]
Mi farebbe piacere averla...
Grazie mille |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 18 aprile 2007 : 20:41:12
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PCR Buffer 11.1X
45 mM Tris-HCl pH 8.8
11 mM Ammonium sulphate
4.5 mM Magnesium chloride
6.7 mM 2-Mercaptoethanol
4.4 uM EDTA pH 8.8
dNTPs 1mM each
113 ul/ml BSA
In bocca al lupo e facci sapere...
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2007 : 09:01:52
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un ultima cosa...il tris base 2M a che pH lo aggiungi ? grazie e scusami se ti rompo continuamente
Ciao
R |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2007 : 15:43:12
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Ah, scusa.. non serve calibrare il pH!
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bisto x
Nuovo Arrivato
Prov.: Trapani
Città: favignana
5 Messaggi |
Inserito il - 16 giugno 2007 : 13:43:31
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qualcuno sa spiegarmi cosa è un rna antisenso?
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LUCIA14976
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 16 giugno 2007 : 14:10:07
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| ciao, in merito alla pcr di 3 kb io uso in genere una taq della takara che è molto affidabile e mi ha permesso di amplificare fino a 10 kb. l'unico inconveniente è il prezzo! |
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pcr...AIUTOOOOO!!!!
Didattica
