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Limpet
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 Inserito il - 04 marzo 2010 : 20:36:10
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Salve a tutti,
facendo una ripassata all'estrazione del DNA col classico metodo dei solventi organici Fenolo Cloroformio e Alcolisoamilico (25:24:1) utilizzati nella fase Purificazione-Separazione e recupero dell’acido nucleico dal lisato cellulare:
Il fenolo e il cloroformio sono liquidi pesanti non miscibili con l’acqua, quindi, se si sbatte fortemente una miscela di acqua e fenolo, per gravità, si vede l’acqua sopra e il fenolo sotto. Una breve centrifugata separa perfettamente le 2 fasi; quindi, in un lisato cellulare, la maggior parte delle proteine e altro, si troveranno nella fase fenolica sotto, o fase organica, mentre gli acidi nucleici si troveranno nella fase acquosa soprastante, e quindi possono essere recuperati.
Ma è solo questo il principio?la non miscibilità dei solventi organici con l'acqua? e l'alcol isoamilico che fa? e, inoltre, va bene utilizzare solo il Cloroformio senza il fenolo o è un errore?io una volta ho fatto così e l'estrazione è riuscita comunque....
saludos!
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 07 marzo 2010 : 17:21:53
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Salve ancora,
Era un pò banalotta, mi rendo conto, la mia domanda, ma sono nuova al tutto.
Inizio quest'anno, son stata qualche mese a imparare le tecniche e ora devo riprodurre tutto nel mio lab, e vorrei avere tutto ...sotto controllo, continuerò ad aggiornare i miei Appunti! intanto ho capito che per liberare la fase acquosa da ogni residuo di fenolo aggiungo al ciclo di miscelazione-agitazione-centrifugazione al fenolo anche cloroformio che ha il duplice effetto di sequestrare il fenolo e di appesantire la fase organica che si separerà ancora più nettamente. Nella miscela fenolo/cloroformio/isoamyl alcohol, il cloroformio denatura e stabilizza l'interfaccia; l'isoamyl è antifoam...ma chi schiuma?le proteine?
continuo.... |
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Fenolo,Cloroformio e Alcol Isoamilico
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