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Discussione |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
 Inserito il - 28 giugno 2006 : 17:19:23
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In cosa consiste, esattamente, la DEPURINAZIONE ?
Mi servirebbe qualche informazione chimica
su cos'è, come avviene, che ruolo ha
nel Southern (anche nel Northern?)
e perchè è tanto importante.
Qualsiasi cosa sappiate!
Sul sito purtroppo non ho trovato nulla
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
 Inserito il - 28 giugno 2006 : 17:47:26
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Grazie davvero...
ma allora sorge spontanea una domanda:
Se io vado a decomporre chimicamente le basi puriniche
com'è possibile far avvenire DOPO una corretta ibridazione,
senza che l'appaiamento tra le basi mi si sputtani?!?!
Eppure il trattamento della membrana con
la sonda avviene sempre DOPO la depurinazione.... |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2006 : 08:21:59
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| Secondo me si potrebbe far legare la sonda in condizioni di bassa stringenza,e sicuramente si appaieranno le altre basi complementari |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2006 : 11:32:59
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Citazione:
ma allora sorge spontanea una domanda:
Se io vado a decomporre chimicamente le basi puriniche
com'è possibile far avvenire DOPO una corretta ibridazione,
senza che l'appaiamento tra le basi mi si sputtani?!?!
in effetti mi sono fatta la stessa domanda anch'io, ma penso che sia una sorta di compromesso:
per trasferire frammenti di DNA grossi "devi" fare la depurinazione altrimenti non si trasferiscono (quindi non avresti ibridazione comunque!!!)
D'altro canto depurinando hai il DNA frammentato e se la frammentazione avviene proprio nella sequenza complementare alla sonda???
Boh, comunque a quanto ho capito non hai una frammentazione completa,(infatti non devi esagerare con i tempi!) forse è per questo che le sonde riconoscono comunque la sequenza.
In ogni caso prova a dare un'occhiata a questo articolo in cui in effetti discutono sull'aumentata o diminuita ibridazione dopo depurinazione:
http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/26/20/4787
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
 Inserito il - 29 giugno 2006 : 17:34:32
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Grazie!! |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2006 : 22:16:41
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| Ma scusa GFPina,a parte che sicuramente viene frammentata anche la sequenza complementare alla sonda,ma qual e' il problema?mica scappano via i frammenti dal gel! rimangono nella stessa posizione e poi verranno trasferiti sul filtro e fai una normale ibridazione.... e' vero pure che la degradazione deve essere parziale |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2006 : 22:57:45
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Citazione:
mica scappano via i frammenti dal gel!
rimangono nella stessa posizione e poi verranno trasferiti sul
filtro e fai una normale ibridazione.... e' vero pure che la
degradazione deve essere parziale
Aspetta Patrizio... la questione potrebbe essere più complessa
Se il mio frammento d'interesse, depurinato, si spezza (ad es.)
in 2 parti di taglio diverso, è vero che si trasferiranno entrambi
nella medesima posizione, ma questo non garantisce a priori
che la sonda possa semi-ibridare presso entrambi.
cioè, per fare un esempio stupidissimo:
sonda
3'TACGGGCTTTCAAACCG 5'
5'ATGCCCG___GTTTGGC 3'
frammento depurinato
in posizione centrale
(spezzato in due)
Ecco...il dubbio sarebbe: come facciamo
ad essere SICURI che avverrà l'ibridazione?
Le risposte potrebbero essere:
- (come dici tu) occorre servirsi delle più
appropriate condizioni di stringenza
- occorre non esagerare con i tempi di
depurinazione e con le conc. di HCl
Per il resto non so. Mi appello ai 'masters' del forum.
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2006 : 23:45:22
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| Secondo me l ibridazione avviene....il DNA rimane intrappolato nelle maglie del gel e a meno che non viene posto in un campo elettrico non si sposta,poi alla fine se si e' proprio sfortunatiche non si lega,riprovi l esperimento |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2006 : 09:59:21
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Scusate Patrizio e Dionysos ma penso che abbiate ragione entrambi!
Citazione:
mica scappano via i frammenti dal gel! rimangono nella stessa posizione e poi verranno trasferiti sul filtro e fai una normale ibridazione....
Citazione:
il DNA rimane intrappolato nelle maglie del gel e a meno che non viene posto in un campo elettrico non si sposta
è vero è frammentato ma rimane nella stessa posizione!
L'unico problema a questo punto è il legame della sonda:
"fai una normale ibridazione" come dici tu Patrizio
ma l'efficienza di legame sarà ridotta nel caso il frammento sia frammentato nella zona riconosciuta dalla sonda.
Cioè LA SONDA SI IBRIDA COMUNQUE MA CON MINOR EFFICIENZA!
Non è un processo tutto o nulla, ma quantitativo.
Infatti se leggete l'articolo dell'ultimo link che ho inviato (persone ben più esperte di noi) parlano di ridotta efficienza di legame della sonda dopo depurinazione che poterbbe influire su analisi quantitative.
Citazione:
Although acid depurination has been shown to cause a 3-5-fold reduction in hybridization to PFGE-fractionated DNA (4), it remains a commonly used technique. In fact, acid depurination of DNA prior to Southern blotting is still recommended, and even considered essential, by some current PFGE protocols (5,6). We have discovered, however, that acid depurination of PFGE-fractionated DNA can have a more profound effect on Southern-blot hybridization levels than was previously appreciated and can significantly compromise quantitative analysis even preventing detection of specific molecules present in samples of genomic DNA.
Spero di essermi espressa meglio stavolta, in effetti prima non ero stata molto chiara! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2006 : 11:59:41
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Dunque l'abbassamento dell'efficienza d'ibridazione è 'necessario'
e quindi tollerato nei limiti del ragionevole... |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
Inserito il - 01 luglio 2006 : 16:14:49
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Nel caso ti servisse pure qualche info sui meccanismi di reazione...
Si tratta di una reazione di idrolisi di legami glicosidici: in particolare riguarda il legame che unisce la base azotata allo zucchero. E' una reazione che avviene spontaneamente in ambiente acido; a pH fisiologico viene catalizzata da DNA glicosidasi.
Esistono ben note differenze di idrolisi per cui:
- i ribonucleotidi sono più stabili dei desossiribonucleotidi
- le purine sono più facilmente idrolizzabili delle pirimidine (se ne perdono 10000 al giorno)
Questo tipo di reazione coinvolge maggiormente le purine, dal momento che il meccanismo di reazione prevede la protonazione (piu' facile per la purine, che possono presentarsi nella forma 7,9dH-purina).
Si ipotizza il seguente meccanismo che prevede la formazione di un intermedio carbocationico. Il DNA privo della base tende a disidratare e poi ad ossidarsi; in pratica si assiste alla formazione di un aldeide a-b-insatura che, essendo estremamente reattiva, tendera' ad ossidarsi. Come risultato finale si osserva la rottura della catena in due tronconi, difficilmente riparabile dai sistemi di controllo cellulari.
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http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2006 : 11:37:42
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E' proprio quello che mi serviva!!!
Ma dove le trovi Korda??! |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
Inserito il - 03 luglio 2006 : 09:34:56
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Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
E' proprio quello che mi serviva!!!
Ma dove le trovi Korda??!
eh eh! Si tratta degli appunti di un corso di metodologie in cui ci venivano spiegate - per l'ennesima volta tra l'altro  - tecniche di analisi su acidi nucleici e proteine (tecniche di sequenziamento, cromatografie, spettrometria MS, dicroismo circolare e robette varie).
Da notare che il corso si chiamava "Analisi dei farmaci biotecnologici II", e ce l'ha fatto un prof che fa essenzialmente molecular modeling (a parte il mio tutor credo che egli sia l'unico di tutto il dipartimento che ci capira' qualcosa della mia tesi, se ce l'avro' in commissione) |
http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 03 luglio 2006 : 19:30:16
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Un CORSO DI METODOLOGIE!!? 
Molla l'osso mezza italia è rimasta senza! eheh
Sarebbe opportuno clonare una schiera di professori "di quel tipo",
che si prendono le palle in mano e la responsabilità sulle spalle
in modo da sopperire alle (sigh!) mancanze di chi -invece- di dovere.
Qui da noi la stragrande maggioranza se ne sbatte della teoria
metodologica , mentre una componente minima si limita a sospirare:
'ah! se qualcuno vi avesse insegnato meglio la metodologia...' |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
Inserito il - 04 luglio 2006 : 08:42:35
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A parte quello che ho citato nel mio CdL ho seguito altri corsi di metodologie un po' piu' approfonditi: alcuni però sono formattati nel vecchio stile (lucidi e via di disquisizioni a penna... dovrei sbobinarli sul computer).
Comunque hai dati una buona idea. ehi, Chick, Atreliu e DallOlio: non si potrebbe aprire un area download in cui condividere i file zippati di corsi che si è seguito (i tuoi appunti della Beringhelli, ad es., sono davvero pregevoli Chick) |
http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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