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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
 Inserito il - 18 marzo 2010 : 21:54:42
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Ciao a tutti sono nuovo qui ma ho un problema che non riesco a risolvere.
Praticamente noi estraiamo il dna dal sangue utilizzando in kit, e dopo lo sottoponiamo a pcr.
Ho provato a fare vare prove come concentrazione del Dna allo spettrofotometro senza importanti differenza, corsa su agarosio. In alcuni la Pcr viene e in altri no.
perchè a volte la Pcr in alcuni campioni non viene? Quali sono le motivazioni principali?
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 18 marzo 2010 : 23:39:41
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Non credo di aver capito bene!
Voi avete estratto DNA da sangue, diciamo vari campioni.
Poi li avete dosati...Le concentrazioni tra vari campioni sono simili mi pare di capire...giusto?
Poi fate una PCR e osservata la corsa su gel...alcuni campioni si vedono, altri no, giusto?
Quindi è come se la PCR non avesse funzionato su alcuni campioni in pratica.. |
 
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2010 : 18:28:24
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Esatto...
La Pcr su alcuni campioni funziona e su altri no...
A dir la verità noi non dosiamo il DNA perchè abbiamo uno spettrofotometro inutile, però ho provato a farlo correre in agarosio 0,8% e il DNA è presente nei campioni.
Abbiamo pensato a due cose:
- Il DNA se estratto da sangue prima congelato può essere compromesso
- Nella metodica di estrazione si usa l'etanolo se non evapora bene può inibite la PCR
Altri problemi? |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2010 : 19:47:21
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Anch'io ho pensato subito alla seconda!
Riguardo la prima, onestamente non saprei...Certo che se i campioni che non vedi sono tutti congelati e gli altri no, qualche sospetto lo avrei!
Immagino poi comunque che avete riprovato più di una volta la PCR, per conferma della reazione.
Se avete la possibilità di dosarli in qualche modo, io comunque proverei. Tipo se reperite un nanodrop, sarebbe interessante anche vedere com'è il picco.
Una volta mi capitò una cosa simile, ma su tutti i campioni, i quali erano molto diluiti.
Risolvemmo aumentando i cicli di reazione. |
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2010 : 21:57:39
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un nanodrop è impossibile al massimo uno spettrofotometro.
Qualcuno ha mai provato a fare la PCR su un campione già amplificato in cui la banda c'è ma si vede poco?
Nel caso è necessario ri mettere tutti gli elementi della mix?
Quanti cicli bastano? |
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mak_steon
Utente Junior
138 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2010 : 14:24:55
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Io ho provato alcune volte riutilizzando esattamente la stessa mix e gli stessi cicli per fare prima; mi è venuta una banda molto intensa, anche troppo, ma mi interessava solo vedere se funzionava quindi non ho fatto altre prove.
Per quanto riguarda il problema iniziale io proverei a fare delle diluizioni dei tuoi campioni e rifare la pcr (anche solo una 1:10 e 1:100). Se c'è così tanto DNA da vederlo su gel non verrà diluito troppo, mentre diluisci eventuali inibenti.
Inoltre potresti provare ad usare la BSA (bovine serum albumin, mi sembra) nella mix di PCR (sempre per gli inibenti).
Ciao |
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bioalex20
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 24 marzo 2010 : 14:36:22
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Sì, gli inibitori possono essere una causa del tuo problema (nei tuoi campioni di partenza vi è ad esempio Eparina come anti-coagulante?) e la stessa emoglobina può inibire la reazione.
La soluzione proposta da mak è decisamente valida (personalmente farei delle diluizioni 1:20 e 1:50).
Potresti fare una prova con quei campioni che non sono venuti facendo di nuovo l'amplificazione con le 3 diluizioni (compresa la 1:1 come controllo negativo).
Anche fare un controllo di estrazione (DNA o plasmide) potrebbe essere una buona cosa oltre a mettere un controllo positivo ed uno negativo nella tua PCR. Mentre questi controlli ti dicono se la reazione è avvenuta correttamente, il controllo di estrazione ti dice se vi è qualche inibitore che ti porti dietro dall'estrazione (ad esempio l'EtOH) o se è invece un'inibitore presente nel tuo campione di partenza.
Facci sapere! ^^ |
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2010 : 11:26:35
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Vi ringrazio veramente tanto per i vostri condigli, due domande:
1) Usare la BSA per inibire gli inibenti? Quanta in che concentrazione?
2) Non ho capito cosa intendi come controllo di estrazione
Questa settimana ho provato a fare un bagnetto termostato ai campioni di DNA (gia nel loro diluente) sperando nell'evaporazione di un eventuale etanolo ma i primi risultati sono abbastanza scoraggianti. |
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2010 : 00:58:42
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| Qualcuno ha esperienza nell'estrazione del dna da sangue? Ho qualche problema nell'estrazione da sangue congelato avete qualche consiglio???? |
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mak_steon
Utente Junior
138 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2010 : 10:11:23
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Citazione:
Messaggio inserito da beppe.cib
Vi ringrazio veramente tanto per i vostri condigli, due domande:
1) Usare la BSA per inibire gli inibenti? Quanta in che concentrazione?
Scusa non avevo visto questa domanda.
Io la uso alla concentrazione di 1 mg/mL.
Ciao |
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2010 : 23:29:50
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| E invece per quanto riguarda la scarsissima (quasi nulla) quantità di Dna estratto da sangue congelato qualcuno ha qualche soluzione? |
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kk74
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
Inserito il - 08 aprile 2010 : 07:37:21
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| prova ad effettuare una lisi dei rossi con l'RBC lysis buffer e a congelare solo il pellet dei bianchi. io mi trovo benissimo. Fammi sapere. ciao |
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 08 aprile 2010 : 09:39:53
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| Il problema è che a me il sangue arriva gia congelato... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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bioalex20
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 12 aprile 2010 : 17:26:14
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Citazione:
Messaggio inserito da beppe.cib
2) Non ho capito cosa intendi come controllo di estrazione
In pratica è un campione di DNA già estratto e che sai essere di buona qualità e quantità e funzionante per le tue PCR (oppure una sequenza da plasmide).
Lo estrai in parallelo alla tua metodica e se da questa estrazione la PCR non ti viene è molto probabile che tu abbia qualche inibitore nella reazione. |
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Zea
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 13 aprile 2010 : 21:26:17
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Citazione:
Messaggio inserito da beppe.cib
un nanodrop è impossibile al massimo uno spettrofotometro.
Qualcuno ha mai provato a fare la PCR su un campione già amplificato in cui la banda c'è ma si vede poco?
Nel caso è necessario ri mettere tutti gli elementi della mix?
Quanti cicli bastano?
Se vedi una banda flebile ma specifica, prova a fare una PCR nested. L'efficienza dell'amplificazione aumenta nettamente.Non ho esperienza in merito all'analisi del DNA estratto da sangue, ma in genere quando amplifico DNA genomico faccio sempre così.
Prova con 30 cicli.  |
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PCR
Didattica
