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valentina72
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
 Inserito il - 04 luglio 2006 : 16:57:41
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ho dei tessuti (cuore, corteccia, polmone, sangue) in etanolo. Come faccio ad estrarre DNA o RNA (con dei kit)? si può? non è che è sono precipitati?
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Vale |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 luglio 2006 : 14:53:20
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No DNA e RNA non dovrebbero essere precipitati perchè nel tessuto hai comunque le cellule intergre!
Comunque ti consiglio prima di procedere all'estrazione di idratare i tessuti (come si fa per le colorazioni di immunoistochimica), cioè falli passare per una scala discendente degli alcoli:
da etanolo assoluto (dove sono), passali in etanolo al 80%, poi in etanolo al 70% (volendo anche in etanolo 30%) e poi in acqua deionizzata. Poi procedi all'estrazione.
Non so la grandezza dei tuoi tessuti, ma penso che una mezzoretta per ogni passaggio vada bene. é meglio se lo fai in agitazione per assicurarti che alcool a acqua penetrino meglio nei tessuti.
Per il sangue però sinceramante non saprei!
Ah magari mantieni i campioni in ghiaccio cosi riduci il rischio di degradazione soprattutto per l'RNA. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 luglio 2006 : 17:00:41
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Citazione:
Piccola nota che non c'entra... per le colorazioni si fa una deidratazione, passando dall'acqua all'etanolo!
dipende da cosa devi fare!
Normalmente quando includi i tessuti in paraffina li disidrati è vero, mai poi se devi utilizzare soluzioni acquose li riporti all'acqua reidratandoli! (x. es se fai una immunofluorescenza).
I passaggi sono gli stessi al contrario ovviamente! |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2006 : 08:40:18
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Non so il DNA,suppongo non abbia problemi, ma spero che per l'RNA tu li abbia poi conservati subito a-80.
E' vero che le cellule restano integre con l'etanolo, ma se l'RNA lo lasci là anche per pochissimo senza metterlo in azoto ( ovvero il pezzo)o a -80, è impressionante quanto rapidamente si degrada.
Penso che per fare una cosa corretta e prima di gettare tempo e denaro (cosa che spesso molti fanno, soprattutto nelle varie università.... come se i soldi non fossero loro....) sarebbe fare una corsa al Bioanalyzer dell'Agilent per vedere la qualità del tuo RNA prima di procedere.
Non so poi cosa tu ci debba fare, ma molto spesso siamo andati avanti e le cose non venivano, per cui siamo tornati al punto di partenza e ci siamo accorti che era l'RNA che faceva schifo. E come noi sai quanti..?
Prova a chiedere se qualcuno lì da te ha lo strumento. Non so di dove sei, se fossi di Padova qualche campione te lo potrei analizzare io, ma fra due settimane, perchè dopodomani parto per le ferie...Abruzzo aspettami!!!!  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2006 : 09:16:47
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
dipende da cosa devi fare!
Normalmente quando includi i tessuti in paraffina li disidrati è vero, mai poi se devi utilizzare soluzioni acquose li riporti all'acqua reidratandoli! (x. es se fai una immunofluorescenza).
I passaggi sono gli stessi al contrario ovviamente!
Ah, ok mi mancava. Noi disidratiamo anche per l'immunofluorescenza :)! |
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valentina9777
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
3 Messaggi |
Inserito il - 14 luglio 2006 : 09:53:55
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ciao , se hai tessuti da cui estrarre gli acidi nucleici, in primo luogo sia DNA che RNA, sono estraibili senza problemi e in teoria non dovrebbero essere danneggiati(...), estrai le cellule dai tessuti , poi attraverso dei kit che utilizzano delle colonnine con membrana (non so se può direil nome dell'azienda..) lisi le cellule (con lyse buffer) , effettui lavaggi (wash solution)insomma segui il protocollo e poi effettui una eluizione con acqua nuclease free con aggiunta dell'rnasi per il dna e per l'rna aggiunta di dnasi.
ecco pronto il tuo genomico se non lo usi puoi metterelo a -20 e per l'rna ricordati di mettere in "mister frostie" contenitore con isopropanolo ( che abbassa la temperatura ) e metterlo poi a -80.
da sangue l'estrazione avviene attraverso centrifugazione 1000rcf x8 minuti.. ottieni un precipitato , un surnatante e nel mezzo il buffy coat. estrai il buffy coat( globuli bianchi)e procedi con il lisaggio come prima un saluto |
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tessuti in etanolo
Didattica
