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CancerResTOU
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
 Inserito il - 23 marzo 2010 : 15:07:22
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Ciao a tutti, ho trovato questo forum sempre molto utile e dato che avrei un problema, che non so se deriva dalla mutagenesi o dalla trasformazione, ho deciso di registrarmi e proporlo, se qualcuno riesce a darmi qualche suggerimento.
Utilizzando il kit stratagene per la mutagenesi volevo inserire una delezione disegnando per questo due coppie di primers per vedere quale delle due coppie funzionava meglio. dopo PCR e digestione con DpnI, ho trasformato in XL1Blue supercompetenti (del kit), su piastre +Amp una coppia di primers ha dato alcune colonie.
l'altra ha dato colonie a tappeto. inizialmente ho pensato che l'efficienza così alta mi dava la possibilità di trasformare in DH5alfa fatte in casa. per prova ho fatto in parallelo piastramento della trasformazione in DH5alfa su +Amp e uno striscio su piastre +Amp e -Amp dalla piastra a tappeto di XL1Blue (tale disparità di efficienza con le altre mi sembrava eccessiva). Risultato: nessuna colonia su nessuna piastra, neanche quelle -Amp.
che cosa può essere successo?
Grazie mille
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CancerResTOU
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
 Inserito il - 25 marzo 2010 : 15:00:06
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alla fine ho rifatto tutto....sono arrivata alla conclusione che sulla piastra iniziale per qualche strano motivo avevo perso l'ampicillina....
Citazione:
Messaggio inserito da CancerResTOU
Ciao a tutti, ho trovato questo forum sempre molto utile e dato che avrei un problema, che non so se deriva dalla mutagenesi o dalla trasformazione, ho deciso di registrarmi e proporlo, se qualcuno riesce a darmi qualche suggerimento.
Utilizzando il kit stratagene per la mutagenesi volevo inserire una delezione disegnando per questo due coppie di primers per vedere quale delle due coppie funzionava meglio. dopo PCR e digestione con DpnI, ho trasformato in XL1Blue supercompetenti (del kit), su piastre +Amp una coppia di primers ha dato alcune colonie.
l'altra ha dato colonie a tappeto. inizialmente ho pensato che l'efficienza così alta mi dava la possibilità di trasformare in DH5alfa fatte in casa. per prova ho fatto in parallelo piastramento della trasformazione in DH5alfa su +Amp e uno striscio su piastre +Amp e -Amp dalla piastra a tappeto di XL1Blue (tale disparità di efficienza con le altre mi sembrava eccessiva). Risultato: nessuna colonia su nessuna piastra, neanche quelle -Amp.
che cosa può essere successo?
Grazie mille
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