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Arf
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 Inserito il - 28 marzo 2010 : 19:02:36
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Salve a tutti, in questi giorni sono alle prese con delle purificazioni di DNA tramite salting out e mi chiedevo se era possibile utilizzare al posto del cloruro di sodio il KCl. Secondo voi ci sono differenze? La loro solubilità è quasi la stessa, l'NaCl un pochino di più in realtà, quello che cambia è il raggio atomico del potassio che è maggiore...questo può influire sulla formazione dei "sali di DNA"?
Grazie.
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2010 : 09:16:24
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sì cambia qualcosa...
Per quanto ne so io il potassio al posto del sodio diminuisce la probabilità (o efficienza) della precipitazione dei piccoli frammenti di DNA, tipo oligo. Infatti il Maniatis consiglia proprio i sali del potassio per purificare i DNA dagli oligo a basso peso molecolare.
Per le proteine non so bene se ci sono differenze nella precipitazione, ma penso che ci siano seppur piccole.
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Arf
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31 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2010 : 08:39:03
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Grazie mille, stò tentando una purificazione rapida di DNA da sangue e le mie rese sono bassissime e stò cercando di capire il perchè, ma forse i 250 ul di partenza sono troppo pochi se non si usano sistemi di cattura del DNA quali colonnine.
Ancora grazie e a presto. |
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beppe.cib
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41 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2010 : 16:56:56
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| Qualcuno estrae Dna da sangue congelato? Io ho qualche problema di resa sapete come risolverlo? |
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Arf
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31 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2010 : 18:31:11
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| A me capita di estrarre DNA da sangue congelato, ma utilizzo un metodo "artigianale" e non lo purifico, alla fine ottengo circa 20 ng/ul, ma con i normali Kit di purificazione le rese sono molto maggiori. Tu che metodo di estrazione utilizzi? |
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beppe.cib
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41 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2010 : 23:32:35
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| Io utilizzo un kit di una marca che ora mi sfugge e ti assicuro che le rese sono pessime se confrontate con il dna da sangue fresco, tanto pessime che la PCR non riesce ad amplificare niente, puoi dirmi il tuo metodo artigianale che magari funziona meglio dei kit. |
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Arf
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31 Messaggi |
Inserito il - 08 aprile 2010 : 19:34:48
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Il fatto che le rese siano minori rispetto ad un campione di sangue fresco credo sia normale, ma non dovrebbe essere pregiudicata l'amplificazione.
Mi spiace ma del mio metodo "artigianale" non posso darti dettagli perchè potrebbe diventare un prodotto (almeno si spera). Posso provare a dirti quello che farei io, anche se forse sono cose che hai già fatto:
1) verifica che l'anticoagulante utilizzato sia compatibile con il tuo kit.
2) prova a fare una scansione allo spettro del tuo estratto che parta da 220 ed arrivi a 320 per verificare la purezza o la presenza di contaminanti.
3) prova ad effettuare una amplificazione utilizzando come templato un diluito 1:2, 1:3, e 1:5 del tuo estratto.
4) prova ad aggiungere TritonX-100 (o NP40) allo 0,05% (dovrebbe aiutare se è presente troppo SDS).
5) se effetui una amplificazione su 25 ul prova a portare il volume a 50 ul aumentando solo di 1,5 volte il volume del templato (se usavi 2 ul di estratto in 25 ul di reazione prova ad usarne 3 ul in 50).
Fammi sapere se le cose migliorano...in bocca al lupo.
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purificazione di DNA tramite salting out
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