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giulella
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 Inserito il - 09 aprile 2010 : 16:21:19
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ciao a tutti!
La domanda che vorrei porvi è se conoscete qualche metodo "homemade" per identificare il promotore di un trascritto. Ho usato diverse volte il kit 5' RACE, ma nonostante costi una fortuna non sono mai riuscita ad avere risultati 
Cosa mi suggerite???
Grazie mille
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
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 Inserito il - 09 aprile 2010 : 21:27:29
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| io ho letto della ligation-mediated pcr. prova con quella, non dovrebbe essere particolarmente difficile e pare funzionare bene, ci hanno clonato diversi promotori. |
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primrose
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 13 aprile 2010 : 19:28:07
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Ciao giulella, anche io sto avendo dei problemi con una 5'RACE.. mi spieghi meglio cos'è che non va nei tuoi esperimenti, così magari possiamo confrontarci e cercare insieme una soluzione per entrambe? :)
tu quale kit utilizzi?
un'altra cosa... in cosa consiste questa ligation-mediated PCR? è un altro modo per ottendere il tailed-cDNA, usando la ligasi invece di TdT?
grazie! |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 14 aprile 2010 : 15:36:03
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In poche parole la ligation-mediated pcr consiste nel frammentare il DNA genomico con uno o + enzimi di restrizione (generalmente un mix), quindi si denatura il DNA e si esegue una primer extension verso la regione 5' upstream del gene in questione (il primer è specifico per il gene di cui vuoi trovare il promotore, quindi devi conoscere almeno la sequenza della parte codificante del tuo gene).Si ottiene un frammento 5' blunt-end a cui si aggiunge un olido double strand a sequenza nota (il linker), e lo si lega tramite DNA ligasi (la reazione è resa direzionale tramite piccoli accorgimenti, quindi il linker si lega solo al 5' del gene in questione). Segue una o più pcr nested usando altri primer gene-specifici parzialmente overlapping come primer a valle (downstream o 3' che dir si voglia) e come primer 5'usi un oligo complementare alla sequenza linker che hai aggiunto tu. In questo modo dovresti ottenere un frammento che comprende parte della regione codificante del gene e una porzione + o - grande del suo promotore (ammettendo che sia a monte del gene stesso e non troppo esteso). La regione regolatrice viene identificata confrontando la sequenza 5' con quella ottenuta da una primer extension dell'mRNA (o cDNA)del gene stesso.
Trovi diverse review o articoli che descrivono la tecnica, io qui te l'ho spiegata in maniera molto semplificata. |
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primrose
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Inserito il - 15 aprile 2010 : 22:16:04
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Uhm... grazie del chiarimento! proverò a leggere qualcosa, anche se non mi sembra la tecnica adatta al mio caso...
nel frattempo sto ricominciando di nuovo una RACE, ho pensato di partire da più RNA, sperando di aumentare l'efficienza di reazione.
l'unica cosa che mi lascia perplessa è la procedura di purificazione del cDNA prevista da questo kit, basata sull'uso di specifiche colonnine. In pratica, dopo averla fatta si recupera poco cDNA (lo quantifico al Nanodrop), mentre ottengo tantissimo segnale nel flow-through. non vorrei che per qualche oscuro motivo mi perdo tutto il materiale durante questo passaggio.
che dite, provo a purificare il cDNA diversamente o a non purificarlo proprio prima di sottoporlo al tailing? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 22:20:48
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| in effetti sapevo che con le colonnine, a fronte di una buona pulizia, si ottiene poco materiale. Io pure utilizzavo questo sistema comunque, però non avevo problemi per quanto riguarda la resa in cDNA (utilizzavo superscriptII, poi però le colonnine per la purificazione nn ricordo di che marca erano). E se non lo purificassi? |
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primrose
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 22:35:13
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Anche io uso la superscript II. per la precisione utilizzo un kit dell' Invitrogen. ci sono le S.N.A.P. column per la purificazione. carico i 25 ul circa della reazione di retrotrascrizione sulla colonnina, aggiungo 120 ul di binding solution e centrifugo. poi faccio vari lavaggi (wash buffer ed EtOH 70%) e poi eluiso con 50 ul di acqua preriscaldata a 65°.
il kit stesso suggerisce di mantenere il flow-through della prima centrifugazione fino a quando non ci si è accertati di aver raccolto il cDNA. Il punto è che non so come regolarmi, nel senso che non so qual è l'efficienza di questa purificazione, in merito alla quantità di cDNA. partendo da 5ug di RNA, sinceramente 10 ng mi sembrano un po' pochini... soprattutto per via del fatto che nel flow-through conto anche 3ug...
se non lo purificassi in teoria non dovrei inficiare il risultato, perchè mi sono consultata con un'altra ragazza che ha fatto delle RACE (per me è la prima volta) e mi ha detto che a lei è capitato di non passare su colonna, ottenendo buoni risultati. |
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SpemannOrganizer
Utente
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Inserito il - 15 aprile 2010 : 22:43:24
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| capisco... beh potresti anche diminuire il volume di eluizione finale per ottenere un prodotto + concentrato.domanda banale: il flow trough e il prodotto finale sono tutti eluiti con lo stesso solvente (acqua per esempio)?quando confronti le varie misurazioni che bianco usi? |
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primrose
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9 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 22:51:37
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il prodotto finale è eluito con acqua, il flow through è praticamente la binding solution che si usa nel primo step di purificazione più tutto quello che non aderisce alla resina.
per provare ad aumentare l'efficienza dell'eluizione finale ho provato a fare due centrifugazioni sequenziali con gli stessi 50 ul di acqua... ma non ha funzionato granchè! |
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SpemannOrganizer
Utente
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Inserito il - 15 aprile 2010 : 23:04:58
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| l'unica cosa che mi viene in mente ora è di provare a purificare con altri metodi, oppure a nn purificare affatto (io a volte facevo così ed andava bene uguale, ma si trattava di RT-PCR)... altrimenti riduci il volume di eluizione, nn ti cambierà la quantità di prodotto finale ma te lo concnentra. Scusa ma ora nn mi viene altro in mente |
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primrose
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9 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 23:07:56
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No, macchè scusa!!!  anzi grazie dei consigli! |
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SpemannOrganizer
Utente
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955 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 23:12:08
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| figurati mi fa piacere |
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giulella
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38 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 23:16:01
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Ciao Primrose!
Io sto usando il kit Ambion ed il protocollo è totalmente diverso dal tuo...non uso nessuna colonnina!
A dire il vero il protocollo è abbastanza simile alla ligation mediated-pcr, suggerito da SpemannOrganizer. In pratica lego un adapter all'estremità 5' e poi faccio la nested usando primer specifici per il mio gene e l'adapter. Purtroppo però quando corro la pcr su gel non vedo nessuna banda chiara, ma solo uno smear . L'ho ripetuta diverse volte e l'unica idea è che magari posso aver sbagliato a scegliere i primer. Tu invece che kit usi? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 23:24:20
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spulciando sulla rete ho trovato questo kit di purificazione, che si basa su beads magnetiche
www.agencourt.com/documents/.../Agencourt_RNAClean_AppNote.pdf
So che la invitrogen ne produce uno analogo proprio per la purificazione di cDNA (mai usato, però ho usato lo stesso sistema invitrogen per la separazione magnetica di proteine/immuoprecipitazione, e funziona da favola). Inoltre ho dato un'occhiata alla mia tesi di laurea, per quanto riguarda la rt-pcr nn era necessario purificare il cDNA, mentre per esperimenti con microarray sì, lo dovevo purificare.
Ecco il protocollo:
Lavaggio del cDNA a doppio filamento
Questa procedura permette la completa ripulitura del cDNA da enzimi e Sali accumulati nelle fasi di sintesi precedenti. Essa si avvale dell’uso di colonnine dotate di resine ad alta affinità per il DNA (“cDNA cleanup Spin Column”) e di tubi di raccolta appositi compresi nel kit:
#1048633; Trasferire il prodotto di reazione degli step precedenti in una eppendorf da 1,5 ml
#1048633; Aggiungere 600 µl di “cDNA Binding Buffer”, controllando che il colore della soluzione rimanga giallo/arancio
#1048633; Caricare 500 µl del campione in una colonnina da purificazione posta su un tubo di raccolta da 2 ml, centrifugare 1’ a 8000g e scartare il liquido di riflusso.
#1048633; Ripetere lo step precedente caricando sulla colonnina il resto del campione di partenza.
#1048633; Trasferire la colonnina su di un nuovo tubo da 2 ml; aggiungere 750 µl di “cDNA Wash Buffer” e centrifugare 1’ a 8000g. Scartare il riflusso.
#1048633; Asciugare le colonnine aprendone i tappi e centrifugando 5’ a 25000g. Scartare riflusso e tubo di raccolta. #1048633; Trasferire la colonnina su un tubo da 1,5 ml e aggiungere 14 µl di “cDNA Elution Buffer” direttamente sulla membrana della colonnina. Incubare 1’ a R.T.
#1048633; Centrifugare 1’ a 25000g • |
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primrose
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 23:25:31
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io uso un kit invitrogen: retrotrascrivo con un primer specifico, lo purifico e lo sottopongo ad una reazione di tailing, che aggiunge al 3' del cDNA prodotto una coda di oligo dC. in pratica la codina di dC è come l'adattatore che usi tu credo... poi uso un oligo fornito dal kit per appaiare il dC e primer specifici sia per la prima PCR che per le nested.
purtroppo ho avuto bande nette solo in un caso (ho purificato e mandato a sequenziare ed erano bande specifiche), ora vedo solo smear... |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 23:31:43
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| smear? ma sei sicura che il tuo rna totale nn sia degradato? |
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primrose
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 23:39:46
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no non è degradato, l'ho controllato su gel.
grazie dei protocolli Spemann, ora dò un'occhiata! |
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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 23:46:44
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| domanda..macome fate a capire dovedovete cercarlo stopromotore? |
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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 23:51:36
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| io dovrei clonare un promotore di un gene in vettore..e non so proprioda dove iniziare.. |
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