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Monix
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 14 aprile 2010 : 20:46:48
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Ciao mi sono appena iscritta al sito e avrei già bisogno del vostro aiuto!!! Qualcuno si occupa di trasfezioni??
io sto seguendo un esperimento con lo scopo di trasfettare delle colture cellulari con plasmidi che contengono il genoma del virus C al fine di ottenere un sistema in grado di generare particelle virali.
I problemi che ho avuto nel corso dell'esperimento sono una miriade (forse anche legati alla mia ignoranza circa molte tecniche di biologia molecolare in quanto sono un medico)ad ogni modo ho questi benedetti plasmidi di circa 11000 basi. li ho linearizzati con i rispettivi enzimi di restrizione partendo da una concentrazione iniziale di ca 10ug.ho corso un gel d'agarosio allo 0,5% e tagliato le bande purificato da agarosio trascritto per ottenere RNA e trasfettato con elettroporatore, bene non è riuscito!
allora sto rifacendo tutto e vorrei evitare di sbagliare.
1: per la purificazione ho usato un kit della quiagen con resina e non con colonnine ma la resa in termini di quantità è stata molto bassa...avete consigli?
2: x la trascrizione ho usato il kit T7 megascript dell'ambion lo conoscete?? il protocollo diceva di partire da 1ug di DNA ma per template corti, per template più lunghi dice di usare tra 0,5 e 2 picomoli di DNA....Come faccio a calcolarmi le picomoli? o meglio quanti ul di campione concentrato a 1ug/ul devo prendere per usare 2 picomoli di template?
per il momento mi fermo qui
grazie a chiunque voglia dare il suo contributo
a presto
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2010 : 22:52:03
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perchè trasfetti l'rna e non direttamente il DNA? l'mRNA è molto + "delicato" del DNA. puoddarsi che la tecnica che usi per trasfettarlo non sia adatta. Ma non mi spiego come mai trasfetti quello e non il DNA. Vabbè io in passato microiniettavo e lipofettavo mRNA in Xenopus, ma è leggermente diverso.
Comunque, per rispondere alle tue domande:
1) quando purifichi da colonnine o da gel perdi sempre un pò di DNA, a volte anche la metà di quello iniziale. La resa finale dipende da quanto DNA usi all'inizio, dalla tua esperienza e dal lavorare pulito. generalmente nella fase finale dell'eluizione è consigliabile aspettare un minutino prima di fare la centrifugazione che ti eluisce il DNA (mi spiego, metti il tuo volume di TE o di acqua per eluire sulla colonnina, direttamente sulla resinina - senza toccarla col puntale mi raccomando!- aspetti un minuto e poi centrifughi). Se non sei sicura di aver eluito tutto puoi anche fare una seconda eluizione, ma ti consiglio di raccoglierla in un altro tubo, non in quello dove hai raccolto il primo eluato altrimenti lo diluisci troppo. I kit in genere consigliano di eluire con un volume tra 20-50 microlitri, puoi giocare su questo per concentrare un pò il tuo DNA purificato.
Quando quantifichi il tuo DNA controlla che sia pulito, che la sua od sia tra 0.1-1 e che il suo 260/280 sia tra 1.8-2.0, è molto importante che sia pulito, solo così avrai una lettura affidabile della sua concentrazione e potrai usarlo senza problemi per le successive operazioni.
2)Il kit lo conosco, c'ho trascritto un sacco di mRNA!si tratta in poche parole di diluire il tuo DNA. ce l'hai concentrato 1 ug/ul? ne vuoi un nanogrammo? lo diluisci 1000 volte. per esempio prendi un microlitro e lo metti in un ml finale di acqua mQ sterile.Se invece ti serve di sapere la concentrazione in moli ecc ti do la formula presa dal sito della promega (io a mente nn me la ricordo)
To convert µg to pmol:
µg x 106pg x pmol x 1 = pmol
1#956;g 660pg N
where N is the number of nucleotides and 660pg/pmol is the average MW of a nucleotide pair.
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Trasfezioni cellulari aiutoooo
