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superilala
Nuovo Arrivato
Città: Rotterdam
30 Messaggi |
 Inserito il - 15 aprile 2010 : 12:12:37
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Vorrei fare una trasfezione stabile su Hela e vorrei usare un costrutto che abbia un promotore bidirezionale in modo da avere la contemporanea espressione della GFP e del mio gene (non posso produrre una proteina di fuzione con la GFP perché il tag ne disturba la funzione)
So che questo tipo di costrutto é usato per le transfezioni lentivirali..mi chiedevo se fosse possibile farlo anche usando la lipofectamna..
Qualcuno di voi ha esperienza con questo tipo di strutture?
Any suggestion is very welcome!!
Grazie!!
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 22:24:16
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| E se utilizzassi una ires? a questo punto avresti un cistrone con due geni regolati dallo stesso promotore, ma non un prodotto di fusione. Altrimenti potresti utilizzare un costrutto codificante per la gfp col dato promotore, e il gene che ti interesse controllato da una seconda copia dello stesso promotore. Nel mio lab c'hanno prodotto degli Xenopus transgenici con questa tecnica... |
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superilala
Nuovo Arrivato
Città: Rotterdam
30 Messaggi |
Inserito il - 16 aprile 2010 : 12:32:46
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...mmm...sarebbe fichissimo ma perdona lígnoranza non so cos''e un IRES..mi puoi girare qualche link che vedo se si puó fare!
..e cmq GRAZIE! |
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superilala
Nuovo Arrivato
Città: Rotterdam
30 Messaggi |
Inserito il - 16 aprile 2010 : 12:52:35
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..ho appena dato un occhiata sul web..mi sembra fattibile..in pratica dovrei costruire una sequenza in questo modo: promotore..gene d'interesse..ires e GFP?...in questo modo dovrei avere la contemporanea espressione delle due proteine giusto?...ma posso transfettare questo costrutto con Lipofectamina o devo ricorrere ad un vettore virale?
...mi chiedo peró quale sarebbe il vantaggio nellútilizzo di una IRES invece del promotore bidirezionale... |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 16 aprile 2010 : 15:23:27
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| Se vuoi usare il promotore bidirezionale usa quello, sinceramente nn ne ho esperienza e non so quali vantaggi/svantaggi ti da. A quanto ne so però son promotori messi fianco a fianco in direzioni diverse, nulla di +. (forse, e sottolineo il forse, la vicinanza di due promotori, anche se opposti direzionalmente, può influenzarne reciprocamente la funzione). Per quanto riguarda la ires, si tratta di una internal ribosomal entry site, cioè una sequenza di riconoscimento a cui si lega il ribosoma eucariotico per iniziare la traduzione di una proteina, anche se questa sequenza non è al 5' ma è interna. E' una strategia sfruttata da molti virus per ridurre le dimensioni del loro genoma ed avere l'espressione contemporanea (in quanto cistrone) all'interno di una cellula eucariotica. Non hai bisogno di trasfettarla con vettore virale. |
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superilala
Nuovo Arrivato
Città: Rotterdam
30 Messaggi |
Inserito il - 16 aprile 2010 : 16:54:51
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...ne discuteró col capo..cmq il tuo suggerimento mi sembra molto interessante...ti ringrazio molto!!
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 18 aprile 2010 : 15:12:28
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I promotori bidirezionali sono utilizzati per fare traSDuzioni lentivirali,
ma nulla ne impedisce l'utilizzo anche in costrutti plasmidici.
Si tratta della scelta migliore per l'espressione coordinata a
livello trascrizionale, in quanto sopperiscono ai difetti delle
IRES (che non sono perfettamente stechiometriche e possono formare
strutture secondarie sfavorevoli nel trascritto) e dei promotori
embricati (che spesso si metilano a vicenda) o dell'ancor peggiore
scelta dei "due promotori identici" (che possono andare molto
facilmente incontro a ricombinazione omologa con escissione).
Concettualmente sfruttano l'esistenza di elementi cis-acting
in grado di funzionare in modo indipendente dalla direzione:
questi sono frapposti a due promotori basali (ad es. hPGK
da un lato e minimal CMV dall'altro) che sono in grado di
funzionare in maniera coordinata, indipendente e pressochè
simile dal punto di vista quantitativo, senza particolari
svantaggi nell'espressione dell'una cassetta rispetto all'altra
(non sono comunque perfettamente stechiometrici: per avere la
perfezione dovresti utilizzare i peptidi 2A...)
Nel caso dei PGK-based, il costrutto base avrebbe un ordine simile:
polyA 3'(cDNA 1) 5' <CMV(minimal)PGK(full)> 5' (cDNA 2) 3' polyA
Unico svantaggio: clonarli è difficilissimo, molto meglio averli
in prestito. Una IRES invece si clona molto più facilmente
(promoter> 5'(cDNA2) 3'IRES 5' (cDNA2) 3' polyA)
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 18 aprile 2010 : 16:08:01
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Per quanto riguarda i promotori bidirezionali ho trovato questo:
http://www.clontech.com/products/detail.asp?tabno=2&product_id=10504
Per quanto riguarda l'ires,nel caso in cui la GFP ti serva come tracer o reporter, non credo proprio che sia importante che i due prodotti genici siano perfettamente stechiometrici (cosa che credo sia veramente difficile da ottenere, a meno che si utilizzi un prodotto di fusione e allora hai un rapporto 1:1).
Se poi si vogliono utilizzare due promotori distinti, lo si può fare tranquillamente, puoi utilizzare anche due promotori distinti se hai paura di ricombinazione omologa tra due promotori uguali(ma mi sembra un evento raro in vettore plasmidico circolare). |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 18 aprile 2010 : 16:14:36
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| Il problema incorre quando il vettore plasmidico si inserisce nel genoma.. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 18 aprile 2010 : 16:24:48
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| Sì vero, però c'è da dire che la ricomabinazione omologa somatica è un evento molto più raro (per esempio della ricombinazione omologa durante la meiosi). Ad ogni modo penso si possa usare tranquillamente la strategia del promotore bidirezionale, in alternativa comunque ci sono diversi altri metodi tutti efficienti. La soluzione forse più semplice sarebbe quella di cotrasfettare due differenti plasmidi, uno con la GFP e l'altro con il costrutto desiderato. |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 18 aprile 2010 : 16:49:31
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Purtroppo accade abbastanza spesso da spingere i produttori di
cellule competenti per i clonaggi a proporre ceppi di E.Coli RecA-
-cioè mutanti per il fattore necessario alla ricombinazione omologa-.
Questo permette di "schivare" il problema in fase preparativa, ma
una volta che arrivi al sistema d'espressione lì i nodi vengono al
pettine (specialmente se si tratta di cellule particolarmente prone
alla homologous recombinatin: staminali embrionali e certe linee).
Ogni scelta ha i suoi vantaggi e svantaggi: la cotransfezione ha
la minima semplicità d'esecuzione ma la massima variabilità, mentre
all'estremo opposto una proteina di fusione unita da peptidi 2A
autoclivanti o da inteine risulta lunga e difficile da clonare, ma
permette una coespressione proteica perfetta (1:1 in western blot).
Sulle IRES ho sentito parecchie lamentele, per questo secondo me
i bidirezionali sono la scelta più "bilanciata", specialmente in vivo.
Certo, se devi farlo su Hela forse una IRES è più che sufficiente
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 18 aprile 2010 : 17:20:58
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I recA e relA deficient-strain assicurano maggiore stabilità dei plasmidi, in quanto teoricamente non vi dovrebbe essere ric omologa tra plasmidi. Ma all'interno dello stesso plasmide la ricombinazione non so quanto sia frequente, indipendentemente dal ceppo batteico. Per quanto riguarda la ricombinazione omologa in cellule staminali, beh tieni conto che gli eventi di ricombinazione omologa sono moooolto rari, e infatti le cellule che poi ti sopravvivono alla doppia selezione sono una piccolissima frazione della percentuale iniziale. In Drosophila DMEL cells in laboratorio ottenevamo una frequenza di integrazione del 10%. E non si trattava di ricombinazione omologa (non ricordo quanto sia nelle ES di topo, ma credo inferiore. E comunque non so quanto senso abbia confrontare cellule diverse,tenuto conto che poi bisognerebbe tener conto del trasfettante usato, dimensioni del vettore ecc).
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Promotore bidirezionale...chi ne sa qualcosa???
Didattica
