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domi84
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Gst
Utente Junior
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 Inserito il - 19 aprile 2010 : 21:14:52
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Ciao domi84.
Io lavoro abitualmente con Mef, ma nn sono commerciali: li faccio io a partire dall'embrione.
Ad ogni modo io parto da una dish da 10cm confluente e da quella congelo 3 vials.
Dopo aver provato vari metodi di congelamento, congelo in tuuto fbs e 10%dmso. Inoltre quando le scongelo faccio sì ke lo scongelamento sia + rapido possibile e sopratt le scongelo in una dish da 6 cm.
Ciao |
Ascoltami con gli occhi... |
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domi84
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angemore
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Inserito il - 20 aprile 2010 : 12:34:31
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Non ho mai visto su un datasheet ma in effetti io le MEF le congelo in FBS + 10%DMSO a partire da una piastra da 100 a circa 80-90% di confluenza (1 solo congelo per dish).
Quando poi le scongelo le ripiastro in dish da 100 e fin'ora mi sono trovata sempre bene |
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domi84
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Inserito il - 20 aprile 2010 : 15:25:08
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Il problema è: quante cell ci sono in una piastra da 100?
Prima mi trovavo anch'io bene a fare i congeli così, ma ora mi sembra che in una piastra da 100 ci siano meno cell...e volevo sapere più o meno quante ce ne sono. |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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angemore
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Inserito il - 20 aprile 2010 : 15:41:55
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Ora sinceramente non ricordo, dovrei controllare sul quaderno ma ti posso rispondere solo domani.
Ma non hai la possibilità di contarle prima di congelarle?
E poi scusa ma non ho capito cosa intendi quando dici che ora ti sembra di avere meno cellule...forse che una volta che le scongeli ti sembrano pochi? |
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angemore
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82 Messaggi |
Inserito il - 20 aprile 2010 : 16:03:42
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Pensandoci un pò mi sembra di ricordare che in una piastra da 100 ce ne siano mediamente 6-8 milioni, ma ti ripeto, devo controllare per essere più precisa perchè ho fatto più volte la conta prima di congelare
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domi84
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Inserito il - 20 aprile 2010 : 17:30:20
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| Sia quando le congelo, che quando le scongelo mi sembrano poche, come se le cell fossero più grandi del solito. (Questo anche a giudicare dai pellet quando le centrifugo) |
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angemore
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Inserito il - 21 aprile 2010 : 10:00:16
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| Hai notato se per caso fanno fatica a crescere e se il terreno diventa giallognolo anche se la piastra non è a confluenza? |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 21 aprile 2010 : 19:25:19
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Ciao domi, scusa se rispondo solo ora.
Il numero di cellule in una piastra da 10 cm è tra gli 8-10 milioni, nel mio caso. Ma è variabile dalla dimensione delle cellule, vero!
Il fatto ke ti sembrano poche anche quando le pelletti, mi fa pensare che forse è proprio quello il momento in cui le perdi!!!
Ti spiego: nel mio caso i mefs sono particolarmente difficili da pellettare: io infatti liso sempre direttamente in piastra! Quando devo pellettarli (ad esempio per congelarli) li centrifugo per 5 minuti a 900rpm.
Come ti ho detto, faccio 3 vials da una pistra da 10 cm confluentissima e quando scongelo un vial lo piastro nella piastra da 6 cm (proprio perchè so ke un po' di cell le ho perse pellettando per congelare).
Comunque prova a contare il numero di cell per piastra da 10 dish prima di congelare, e ricontale dopo averle scongelate e vedi se quello è il problema (oppure, se ti vuoi togliere la curiosità, ricontale dopo averle solo pellettate: fai una prova estemporanea).
Il fatto ke siano diventate + grandi e ce ne sn meno in una piastra è meno probabile, a mio avviso, a meno ke non abbiano fatto davvero un gran numero di passaggi. In tal caso potrebbero avere abberrazioni cromosomiche ed instabilità genomica anche orami... quindi forse sono mostri tali ke eviterei di usarli per esperimenti importanti. Non so!
In bocca al lupo. facci sapere. |
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domi84
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angemore
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Inserito il - 22 aprile 2010 : 11:27:57
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Citazione:
Quando devo pellettarli (ad esempio per congelarli) li centrifugo per 5 minuti a 900rpm
Puoi anche pellettare tranquillamente per 5' a 1100rpm, io lo faccio abitualmente e le cellule dopo lo scongelamento stanno bene. Forse così te ne perdi di meno quando aspiri il mezzo.
P.S. poi ho controllato e ti confermo che anche io ne ho all'incirca 8 milioni per piastra.
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