Quanto è utile/interessante questa discussione:
| Autore |
Discussione |
|
|
0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
 Inserito il - 21 aprile 2010 : 14:15:21
|
Premetto che ho già ampiamente navigato nelle pagine (funzione cerca inside), senza ahimé trovare la risposta chiara al mio dubbio.
La questione riguarda la Real-Time PCR.
Ora, da quello che mi è parso di intendere, è possibile effettuare una quantificazione assoluta del DNA iniziale grazie al momento in cui è raggiunto il ciclo soglia, sfruttando la capacità di fluorofori vari di "seguire" passo passo, ciclo dopo ciclo, l'incremento di DNA. Per fare ciò si può costruire un grafico fluorescenza in funzione del n. di cicli. Il ciclo soglia corrisponderà ad un determinato valore di fluorescenza emessa, scelto dallo sperimentatore con l'unica limitazione che cada nella fase esponenziale di amplificazione.
Scusate il monologo, la ricapitolazione è scritta solo perché possiate eventualmente smentirla.
Proseguendo, è possibile realizzare altre amplificazioni, di concentrazioni e dunque quantità di DNA note, ricavando anche per questi esperimenti i rispettivi cicli soglia. Ciò permette di realizzare un grafico dei cicli soglia in funzione della concentrazione logartimica dell'acido nucleico. Da qui si ricava una retta di taratura, su cui sarà possibile interpolare, conoscendo il ciclo soglia del nostro campione da quantizzare, il log della concentrazione di inizio PCR. Giusto?
Cerco di concludere con le mie questioni:
- i campioni che uso per costruire la retta di taratura sono dello stesso acido nucleico che voglio quantizzare?
- è possibile dalla fluorescenza ricavare la quantità di amplicone in quel momento e dunque applicare l'inverso della formula
Molecole totali = molecole iniziali x (1+Efficienza)^n.cili
per ricavare le molecole iniziali? Le SyBR si legano in maniera stechiometrica, no? Sebbene aspecifica (sovrastima dell'amplicone).
- l'efficienza in fase esponenziale è del 100%? In teoria si, perché tutti i reagenti sono presenti in abbondanza, ma in pratica non conosco l' "esclusività" del legame con i target.
Forse ho altre domande, ma al momento non me ne ricordo...
Grazie anche a chi solo ha avuto abbastanza pazienza da leggere tutto.
|
|
|
|
|
cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 21 aprile 2010 : 14:45:54
|
Citazione:
- i campioni che uso per costruire la retta di taratura sono dello stesso acido nucleico che voglio quantizzare?
se per acido nucleico intendi gene, la risposta è si: ogni volta che amplifichi un gene devi fare la retta di taratura usando i primers per quel gene (quindi per ogni real time dovresti avere la retta per il gene target e per il normalizzatore..). non necessariamente invece il cDNA deve provenire dalla stessa reazione, anzi, spesso si usano gli stessi standard per più real time..
Citazione:
- è possibile dalla fluorescenza ricavare la quantità di amplicone in quel momento e dunque applicare l'inverso della formula
Molecole totali = molecole iniziali x (1+Efficienza)^n.cili
per ricavare le molecole iniziali?
in linea teorica si, però devi conoscere l'efficienza della reazione...
Citazione:
- l'efficienza in fase esponenziale è del 100%?
mica sempre!!
Citazione:
In teoria si, perché tutti i reagenti sono presenti in abbondanza, ma in pratica non conosco l' "esclusività" del legame con i target.
questa parte non l'ho capita...
mi spiego per quanto riguarda l'efficienza: come dici tu, in teoria l'efficienza dovrebbe essere del 100%, ma nella pratica non è sempre così, e questo lo verifichi quando fai il grafico della tua retta di taratura, infatti questa avrà un suo slope, e l'efficienza della reazione corrisponde a {[10^(1-slope)]-1}. quando lo slope è di -3,3 , E=1.
poi comunque, quando fai la retta di taratura per gene e normalizzatore, dovresti fare il DCt delle varie diluizioni che hai usato (Ct del gene target - Ct del normalizzatore per ogni punto della retta), e poi graficare questi valori mettendo sulle y i valori di DCt e sulle x il log delle concentrazioni usate. se l'efficienza delle due reazioni (PCR per target e PCR per normalizzatore) è simile, avrai una retta con slope vicino a 0, quando questo non avviene è perchè in una delle reazioni, l'efficienza cambia in base alla concentrazione del templato. quello che è importante normalmente non è che l'efficienza sia pari a 1 (anche se quello sarebbe il top), quanto che l'efficienza dei primer che usi per il tuo target sia sempre costante (cioè non oscilli a seconda della quantità di templato) e sia simile a quella dei primer del normalizzatore...
spero di aver centrato il punto delle tue domande...  |
 |
|
|
0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 21 aprile 2010 : 14:57:03
|
Citazione:
Messaggio inserito da cami
Citazione:
- i campioni che uso per costruire la retta di taratura sono dello stesso acido nucleico che voglio quantizzare?
se per acido nucleico intendi gene, la risposta è si: ogni volta che amplifichi un gene devi fare la retta di taratura usando i primers per quel gene (quindi per ogni real time dovresti avere la retta per il gene target e per il normalizzatore..). non necessariamente invece il cDNA deve provenire dalla stessa reazione, anzi, spesso si usano gli stessi standard per più real time..
Per il momento vorrei investigare un attimo di più su questo punto, che è quello più scottante per il mio esame. Innanzitutto però grazie per la risposta e la sua prontezza.
Temo di non aver completamente capito la parte grassettata. In pratica, ciò che più mi interessa sapere è se, nel caso io abbia amplificato una sequenza di DNA in Real Time PCR, io debba usare per costruire la retta di taratura concentrazioni note della stessa sequenza di DNA amplificata, oppure sia possibile usare altre sequenze. Ciò che conta è che l'efficienza di amplificazione sia simile immagino. |
|
|
|
cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 21 aprile 2010 : 15:33:30
|
beh, nel caso della retta di taratura non puoi usare primers per un gene diverso dal tuo, nemmeno se l'efficienza è simile: devono essere esattamente quelli del gene che stai analizzando. in genere la procedura è questa: se parti da RNA, dopo la retrotrascrizione vorrai analizzare l'espressione del gene in diversi campioni (es. controllo vs trattato, normale vs tumorale, etc). a quel punto ti prepari i tuoi campioni con uguali quantità di cDNA, e ci associ, nella stessa piastra, la retta di taratura per il gene target, usando varie diluizioni (almeno 5) di cDNA. in questo caso, i primers che usi devono essere gli stessi, sia per i campioni che per gli standard, mentre il cDNA che usi per costruire la retta può essere uno di quelli che stai investigando, così come un cDNA proveniente da un altro esperimento (questo significa che non è necessario ripreparare le diluizioni tutte le volte che fai una real time: puoi farle una volta, conservarle e usarle più volte). la stessa cosa la fai per il normalizzatore, usando quindi i primers del normalizzatore... non puoi assolutamente usare altre sequenze per fare la retta di taratura, ma deve essere per forza la stessa sequenza per la quale stai valutando il Ct dei campioni, altrimenti non potrai MAI essere sicuro che la tua retta sia attendibile.. è per questo che la retta si fa anche quando amplifichi il normalizzatore, anche se l'efficienza di amplificazione del gene target e del normalizzatore dovessero essere simili (retta piatta col sistema che ti dicevo del DCt)...
forse questa risposta era un po' prolissa, ma spero di essere almeno riuscita a toglierti il dubbio che avevi... |
|
|
|
0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 21 aprile 2010 : 16:08:53
|
Domanda riassuntiva, di modo da avere tutto chiaro: se ho cDNA di insulina, concentrazione ignota, e voglio quantificarlo in Real Time, devo usare cDNA di insulina a concentrazioni note per la curva? Direi di si.
|
|
|
|
cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 21 aprile 2010 : 16:30:36
|
yes! per essere proprio precisi, devi usare primers per l'insulina su cDNA a concentrazioni note  |
|
|
|
0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 21 aprile 2010 : 16:38:59
|
Bene, questo era il punto chiave. Sei stata gentilissima, davvero.
Se passi a Trieste hai uno spritz garantito, oppure un gelato. O entrambi. O uno spritz gelato.
Mi chiedevo una cosa ultima, spero... Se io voglio sondare l'espressione di un gene X, devo quindi prima essermi sintetizzato in lab il suo cDNA, o per lo meno averlo isolato, misurato l'assorbanza a 260 nm dopo amplificazione per ricavarne la concentrazione e quindi effettuare con diluizioni dell'amplicone a concentrazione ora conosciuta le Real Time necessarie alla costruzione della retta di taratura per l'analisi dell'espressione di X?
Grazie |
|
|
|
cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 21 aprile 2010 : 17:22:38
|
beh, in realtà non è neanche così semplice... la procedura che conosco io per la preparazione degli standard prevede questo:
- retrotrascrizione dell'RNA (usando anche oligo dT e/o random primers, non necessariamente primers specifici)
- amplificazione della sequenza di interesse (usando i primers per X): per PCR o real time (il che ti consente di valutare anche la curva di melting per vedere la specificità dei primers...)
- corsa su gel d'agarosio (se tutto va bene ci dovrebbe essere una sola banda)
- taglio della banda e purificazione su colonnine (questo per avere una quantificazione attendibile del DNA, altrimenti tutti gli altri reagenti della mix di PCR ti possono alterare la lettura)
- lettura allo spettrofotometro
- preparazione delle diluizioni
- real time con le diluizioni così ottenute |
|
|
|
cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 21 aprile 2010 : 17:46:01
|
| oh, mi ero dimenticata!!! lo spritz gelato??! varrebbe il viaggio fino a Trieste... |
|
|
|
angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
Inserito il - 22 aprile 2010 : 11:46:06
|
Io invece per prepararmi le diluizioni seriali del mio gene x usavo semplicemente dei plasmidi contenenti la sequenza di mio interesse, li quantizzavo e facevo delle diluizioni seriali. Ovviamente prima di fare il primo esperimento, testavo le diluizioni facendo una real time usando strip da 8 pozzetti in modo tale da non sprecare materiale.
I plasmidi sono comodi da usare ma alcuni li sconsigliano perchè dicono che è più alta la probabilità di contaminare, usando però le dovute accortezze devo dire che non mi è capitato quasi mai. |
|
|
|
0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 01 maggio 2010 : 14:19:48
|
Grazie ancora a tutti!
Spritz gelato già in viaggio per tutt'e due. |
|
|
| |
Discussione |
|
|
|
Quanto è utile/interessante questa discussione:
| MolecularLab.it |
© 2003-18 MolecularLab.it |
|
|
|
Quantificazione con Real-Time PCR
Didattica
