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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
 Inserito il - 24 aprile 2010 : 11:43:27
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Ciao ragazzi!
Avrei bisogno del vostro aiuto e "intuito"!
In lab abbiamo una linea di topi overesprimenti il il gene Apaf1.
Questa è presente da molto prima che arrivassi io e andando a scrutare il libro dei topi, è riportato lo schema del costrutto del topo disegnato a mano e senza troppe spiefazioni  che, essendo io molto ignorante in materia, non riesco ad interpretare.
Lo schema è:
LoxP - BFP - LoxP - Apaf1 - IRES - LacZ
Il mio interesse è sapere se, un topo non floxato, overesprime Apaf1 fuso alla BFP(blue fluorescent protein) o la sola proteina Apaf1.
Help
Grazie in anticipo!
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Ascoltami con gli occhi... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2010 : 11:50:00
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Cosa intendi con "topo non floxato"?
Io leggendo così intendo:
1) topo LoxP - BFP - LoxP - Apaf1 - IRES - LacZ
Esprime BFP, Apaf1 e LacZ
2) topo LoxP - BFP - LoxP - Apaf1 - IRES - LacZ x topo Cre
Esprime Apaf1 e LacZ
Strano come costrutto, quale sarebbe il vantaggio? |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2010 : 12:06:11
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Grazie chick per aver già risposto
Non so dirti l'ultilità di questo costrutto...
D'altra parte nel mio caso, se Apaf fosse fuso alla BFP potrei fare dei Mef dal topo e andare a vedere apaf per fluorescenza: mi servirebbe per risolvere il problema di un collaboratore ke non riesce a vedere Apaf endogeno in IF e non riesce ad overesprimerlo nei mefs di topi wt.
Ti posso dire, però, ke i ragazzi + grandi del lab mi hanno detto ke lacZ non è tradotto: c'è l'Ires a monte di apaf1 che ne media la traduzione del mRNA cap-indipendente, ma essendo, nel trascritto, a valle di lacZ, lacZ non viene tradotto.
Questo a me sembra filare! Non credi?
Comunque anche io avrevo interpretato il costrutto come te
(tranne che per lacZ).
Quindi, dopo queste lacunose informazioni  dici che il topo non incrociato con il cre esprime apaf fuso a BfP?! 
Grazie ancora! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2010 : 12:22:38
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Ok, lasciamo perdere lacZ che comunque non ci interessa....
Il fatto è che tu hai loxP-BFP-loxP.
Il "floxaggio" di BFP di per sè non dovrebbe avere alcun effetto, quindi normalmente BFP sarà espressa.
Quando incroci con Cre, tutto quello che sta tra i siti loxP viene exciso, quindi tu parti da:
----loxP--------BFP--------loxP-------Apaf1
e in presenza di Cre ottieni:
----loxP-------Apaf1
Quindi normalmente hai BFP e Apaf1, con Cre avrai solo Apaf1.
Per questo dico che è un po' strano, ma magari mi sfugge qualcosa. |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2010 : 12:38:57
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Sono d'accordissimo con te! E' strano ke uno faccia in modo che incrociando il topo con un cre "salti" via la BFP!
In genere, visto il lavoro per fare un condizionale,non viene di certo fatto per far saltare la proteina di fusione!
Ad ogni modo, forse farei prima provare ad usare dei primers specifici per BFP e per pcr controllare se i topi positivi per apaf overesprimono anche BFP.
Credi sia possibile?
Grazie qd ogni modo e scusa l'assedio di domande! |
Ascoltami con gli occhi... |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2010 : 12:54:34
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| Addirittura credo ke potrei usare primers per la gfp (controllando dove si appaiano), dato ke la bfp e la gfp, se nn sbaglio, si differenziano in sequenza per pochi amminoacidi. |
Ascoltami con gli occhi... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2010 : 13:37:55
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Magari è semplicemente lo schemino fatto a mano che ha qualcosa di sbagliato!
Ma l'avete generato voi? Non hai modo di contattare chi ha fatto il topo per avere più dettagli?
Citazione:
Ad ogni modo, forse farei prima provare ad usare dei primers specifici per BFP e per pcr controllare se i topi positivi per apaf overesprimono anche BFP.
Sì immagino sia una possibilità.
Citazione:
Addirittura credo ke potrei usare primers per la gfp (controllando dove si appaiano), dato ke la bfp e la gfp, se nn sbaglio, si differenziano in sequenza per pochi amminoacidi
Questo non te lo so dire, dipende un po' dai primers ovviamente! |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2010 : 13:44:40
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Hai ragione! Insistere per saperne di + da chi ha fatto/utilizzato il topo sarebbe + econimico e saggio... e magari mi permetterebbe di stare + sicura di quello che vado ad usare...
Grazie 1000. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2010 : 14:41:32
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Sei sicura che la bfp sia fusa con Apaf1? Se non sono fuse, cioè se non è un costrutto chimerico, solo bfp dovrebbe essere espressa (perchè presumibilmente il suo mRNA porta un codone di stop e non ci sono ires a valle di essa). Quale è il promotore che regola la BFP? Questo costrutto mi stimola parecchio. perchè se io uso una cre tessuto specifica, avrò la possibilità di eliminare la bfp solo in un determinato tessuto, o gruppo di cellule, e il promotore che prima regolava la bfp ora regolerà la apaf1-ires-lacz. Qual'è il vantaggio di questo?hai la possibilità di monitorare sia i tessuti in cui apaf non è espresso (tramite BFP) sia quelli in cui è espresso (tramite lacz). in questo modo puoi studiare possibili interazioni cellulari e guardare come si comporta un tessuto dopo aver eliminato un gruppo di cellule (apaf1 codifica per un complesso pro-apoptotico). Occhio questa è solo una mia ipotesi, cerca di trarre qualche info in +!
Sono curioso comunque!
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2010 : 23:51:35
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| dimenticavo, l'espressione della gfp potrebbe servire anche per lo scoring degli animali transgenici |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 00:49:39
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concordo con spemannorganizer.
Il costrutto é elementare.
Viene trascritta la bfp costitutivamente, é innoqua e può servire per valutare la tessuto-specificità.
2. Una volta attivato la ricombinazione c'é l'iperespressione del gene apaf che é possibile valutare attraverso l'attività i lacz.
L'ires darebbe bassa espressione a lacz, ma dato che dà un segnale molto forte ciò basta.
É possibile valutare la ricombinazione tramite pcr classica tra bfp e apaf, oppure all'esterno di loxp-bfp-loxp, normalizzato per pcr su lacz o apaf.
L'idea del costrutto é buona.
Escludo categoricamente che i siti loxp possano essere tradotti in proteina, hanno tre siti di stop in tre frame. Le sequenze loxp senza codone di stop non possono essere usate in vivo per la bassa efficienza.
Ci sarebbero dei problemi che non so se sono stati affrontati.
1 i siti loxp hanno una discreta consensus kozac con atg in un solo verso, é stato usato il verso giusto?
2. Ires deve essere testato, prima in vitro, spesso non funziona nri costrutti o con certi cdna.
3. Bfp é una delle peggiori proteine fluorescenti, mi pare che si degrada subito e comunque dà scarso segnale. Sono necessarie accorgimenti tecnici per vedere/filtrare questo segnale.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 01:12:47
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Sì, ma a quale scopo valutare la tessuto specificità per *perdita* di fluorescenza? Di solito si fa il contrario (es. con le linee ROSA26-XFP)
Concordo con neuroscience sul fatto che la BFP, come la gran parte dei dye blu, non sia il massimo in termini di photobleaching, ma se osservata opportunamente si riesce comunque ad avere un buon segnale (poi ovviamente dipende tutto dalla bontà del microscopio). |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 01:20:23
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Concordo con chick, non ha senso: in molti tessuti non si
vedrà fluorescenza solo perchè magari il locus che ospita
il transgene inserito è stato silenziato epigeneticamente.
Non è possibile distinguere questo evento dalla mancanza
di attività di Cre, per cui la valutazione *in negativo*
sarà di un'approssimazione tale da risultare insensata.
Poi per non saper né leggere né scrivere mi chiedo: è furbo usare uno
staining immunochimico BLU per distinguere in negativo da cellule che
emettono un segnale fluorescente...BLU?? (a meno che non esistano
altri substrati per LacZ sufficientemente buoni, oltre all'arcinoto Xgal) |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 01:22:55
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Citazione:
Il costrutto é elementare.
Viene trascritta la bfp costitutivamente, é innoqua
aaaargh! questo è ancora più ELEMENTARE!   |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 01:29:54
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Citazione:
i siti loxp hanno una discreta consensus kozac con atg in un solo verso, é stato usato il verso giusto?
Mh, qui invece non capisco bene a cosa vuoi arrivare.
E' così fondamentale servirsi di quella precisa Kozak che è propria ai LoxP?
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 02:10:34
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mi spiego meglio...
obiettivo: generare un topo che in un dato momento e/o in un determinato tessuto esprima il gene apaf
problemi:
1) come fermare la codifica del cDNA di apaf fino a che la ricombinazione abbia luogo?
(a) mettere un triplo segnale di polyA, (b) mettere un cDNA qualsiasi ed innocuo
2) il promotore codificherà come previsto dopo la modifica genica nei tessuti e nei tempi previsti? se faccio una coltura in vitro come posso riconoscere le cellule potenzialmente inducibili o non ancora indotte? Come posso individuare il momento in cui il promotore funziona in vivo/in vitro?
(a) mettere un marker che si estrae dopo la ricombinazione (b) fare una pcr per ricombinazione in maniera cellula specifica (c) fare un time-course
il marker BFP risolve sia il punto 1 che le domande nel punto 2
3) come posso riconoscere la ricombinazione?
(a) uso lacz e con BFP valuto la % di cellule potenzialmente utilizzabili.
forse non sarà il miglior costrutto del mondo, ma ha un suo perché se è congeniato in questo modo |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 02:17:42
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veniamo alla kozak e i loxP
se il locus è concepito come immagino, ovvero
promotore---loxp-BFP-loxp--apaf_IRES_lacZ
se il primo loxp è messo nel verso sbagliato, ha una sequenza ATG preceduta da una buona sequenza kozak, in 2 frame di lettura.
Per cui BFP potrebbe essere codificato con amminoacidi a caso all'inizio oppure potrebbe non essere codificato in frame.
Stesso discorso per apaf dopo la ricombinazione
promotore---loxP--apaf_IRES_lacZ
anche in questo caso ci si potrebbe trovare in difficoltà
Il caso migliore è avere un verso dei loxP che non dia ATG anticipati che metterebbero a rischio tutto il resto.
Nei KO le sequenze LoxP generalmente sono posti negli introni, quindi nessun problema riguardo agli ATG, ma in questo caso, vicino ad un promotore e prima di un cDNA bisognerebbe valutare quale verso dei loxP sia più conveniente.
Lo dico poiché capitò a me un po' di tempo fa in 2 topi, dovetti cambiare il verso dei loxp negli ultimi stadi del costrutto.
spero di essere stato chiaro
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 09:23:53
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@Neuroscience
Citazione:
Forse non sarà il miglior costrutto del mondo, ma ha un suo perché se è congeniato in questo modo
Ok, allora siamo d'accordo. Il mio dubbio non era sul fatto che funzionasse o meno, ma sul fatto che si potrebbe fare un modello più "semplice" e che dia risultati più sicuri.
Ad es. un floxed-stop con in coda APAF e XFP. Questa strategia funziona in generale molto bene. APAF verrà overespresso (perchè se non erro APAF è espresso comunque costitutivamente dalle cellule murine) solo se lo stop è stato eliminato, ed in quel caso verrà anche espressa XFP.
@Dionysos
Citazione:
Poi per non saper né leggere né scrivere mi chiedo: è furbo usare uno staining immunochimico BLU per distinguere in negativo da cellule che emettono un segnale fluorescente...BLU?? (a meno che non esistano altri substrati per LacZ sufficientemente buoni, oltre all'arcinoto Xgal)
Premesso che in generale non è furbo usare un segnale fluorescente blu, la cosa che ritengo non furba è piuttosto il fatto di avere 2 segnali che devi guardare in modo diverso. Sarebbe stato meglio allora avere due diverse varianti di XFP. Detto ciò non credo che XGal interferisca specificamente con BFP per il fatto di essere blu (comunque non lo guardi in fluorescenza) ma piuttosto perchè può formare dei precipitati. E' un po' come fare una doppia IHC con DAB e un marker fluorescente: ci riesci ma se la fluorescenza non è forte è problematico.
Esistono comunque analoghi di XGal, come SALMON-Gal e Magenta-Gal che non sono blu ovviamente!
=======
Ad ogni modo ribadisco, piuttosto che stare qui a fare mille supposizioni la cosa migliore sarà di chiedere a chi ha fatto il topo! Magari lo schemino è incompleto e ci manca un particolare cruciale!!!! |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 09:30:14
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sei stato chiarissimo Neuro ;). So comunque che esistono diverse sequenze loxP "migliorate" in un certo senso,e con diversa specificità di ricombinazione, mi viene da chiedere quali abbiano usato.
Io sinceramente questo costrutto lo apprezzo. Escludiamo per un momento i vari effetti posizionali, sui quali possiamo far poco (si potrebbe cercare di "isolare" il costrutto con insulators, pratica già usata). Se un topo BFP floxed Apaf1-ires-LacZ non esprime la BFP per effetto posizionale, difficilmente potrà esprimere Apaf1. Effetti mosaico sono pure possibili, ma la stessa ricombinazione da parte della Cre non è sempre efficiente al 100%, il che comunque potrebbe dare luogo a mosaicismo.
Tra i nostri topini transgenici comunque osserveremo (HOPEFULLY) alcuni che esprimono la bfp e quindi avranno fluorescenza blu (se è intensa o meno non saprei dirlo, so però che esistono una gran varietà di proteine fluorescenti ingegnerizzate, come mCherry, la cyan fluorescent protein etc, alcune delle quali usate per creare un fantastico modello in topo chiamato brainbow). Utilizzando questa fluorescenza, la selezione dei transgenici risulta molto semplice.
Nel momento in cui vado a fare la ricombinazione, succedono due cose: perdo la bfp e si attiva Apaf1.
Ammettiamo che questo avvenga nelle cellule beta del pancreas (perchè la Cre era sotto il promotore dell'insulina, per esempio). Queste cellule sono blu NEGATIVE, mentre tutto il resto avrà ancora la fluorescenza blu. Questo ci porta immediatamente a individuare quali cellule hanno subito ricombinazione e quali no. Non è del resto nulla di nuovo. Avete presente la ricombinazione somatica indotta da heatshock in Drosophila? In questo tipo di ricombinazione si generano due diversi cloni cellulari, un gruppo di cellule che esprime il gene w.t. solitamente identificabile con l'espressione di gfp. L'altro gruppo di cellule, mutante, non mostra alcuna fluorescenza. E' un modo come un altro per distinguere cellule mutanti da wt nello stesso organismo,solo che è l'opposto di quanto siamo abituati a vedere. Nulla di così strano però.
Ritorniamo però al nostro costrutto. Questo ha un altro vantaggio, evidenziato già da Neuroscience. Riduce al minimo la possibilità di promoter leakage. Giacchè la bfp (con il suo codone di stop e il segnale polyA) è upstream ad Apaf1 questo impedisce la sua espressione sia da un punto di vista trascrizionale che traduzionale. Ciò assicura che questo gene non venga espresso finchè non lo desideriamo noi (atraverso la ricombinazione).
In ultima analisi, l'espressione di Apaf1 può essere monitorata con l'utilizzo di lacZ. Non necessariamente dobbiamo utilizzare l'X-Gal, che da un precipitato blu, ma possiamo utilizzare la Salmon gal, che da un precipitato di colore rosa. Altrimenti si possono utilizzare anticorpi disponibili in commercio e funzionanti contro la beta gal (o lacz che dir si voglia).
Scusate se mi son dilungato. Ripeto il costrutto ha una sua logica e in teoria potrebbe funzionare.
Non so se da i problemi accennati da Neuroscience, ma in questo caso una volta perfezionato potrebbe dare soddisfazioni.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 09:50:01
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Penso che siamo tutti d'accordo su come funzioni il topo.
Il mio problema sta qui:
Citazione:
Ammettiamo che questo avvenga nelle cellule beta del pancreas (perchè la Cre era sotto il promotore dell'insulina, per esempio). Queste cellule sono blu NEGATIVE, mentre tutto il resto avrà ancora la fluorescenza blu.
Le cellule non fluorescenti saranno:
1) cellule in cui Cre è espressa
oppure
2) cellule in cui per qualche motivo l'espressione di BFP è silenziata.
3) cellule in cui BFP è stata degradata...
Certo, lo puoi sapere perchè anche nel topo non incrociato con Cre quelle cellule saranno negative, ma beccare delle cellule negative in un topo tutto fluorescente è molto più difficile che vedere delle cellule positive in un topo che non è fluorescente con il sistema che ho descritto sopra.
Ovviamente anche nel caso del topo con marker positivo si ha il problema che i sistemi Cre-lox funzionano da lineage marker. Se la cellula ha espresso Cre un giorno durante lo sviluppo embrionale quella cellula e tutti i suoi derivati avranno excisione anche senza esprimere Cre. Questo è un tipico problema che si ottiene con queste linee, ma c'è poco da fare a riguardo a meno di non usare Cre inducibili. |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 09:55:44
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Allora... confessando ke ho creato una discussione che mi sta sfuggendo di mano (sono abbastanza ignorante in questo campo  ) e non sono riuscita a seguirvi in ogni vostro ragionamento...
Una cosa che a me è stata detta è ke il topo non incrociato con il cre già overesprime apa1!
Quindi quando neuroscience dice che la bfp è espressa costitutivamente, e dopo l'incorcio col cre "salta" la bfp e viene espresso apaf, CREDO sbagli (stando a quanto mi hanno detto in lab coloro ke sono lì da prima di me!).
Inoltre, avete detto ke i siti loxP hanno 3 codoni di stop: quindi possiamo star certi ke Apaf1 NON è fuso alla bfp, se non ho capito male!
Grazie a tutti |
Ascoltami con gli occhi... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 10:28:41
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Indubbiamente non possiamo essere sicuri di tutti questi ragionamenti se lo schemino è sbagliato.
Ho trovato però sulla rete questo lavoro, dove utilizzano un sistema simile
The FASEB Journal express article 10.1096/fj.02-0438fje. Published online February 19, 2003.
Inoltre leggendo in quà e là avevo visto qualcosa di simile.
Vi segnalo anche un lavoro su drosophila dove utilizzano un sistema differente ma concettualmente simile (per quanto riguarda la selezione fluorescente negativa):
Current Biology, Vol. 13, 2065–2072, December 2, 2003, #63721;2003 Elsevier Science Ltd. All rights reserved. DOI 10.1016/j.cub.2003.10.063
Regulation of Stem Cell Maintenance and Transit
Amplifying Cell Proliferation by TGF-beta Signaling
in Drosophila Spermatogenesis
Chick80, se hanno usato un reporter che fa schifo, cioè una bfp che si degrada o bleacha subito sono dei brodi, che ti devo dire :).Immagino abbiano usato un buon reporter, almeno spero per loro.
Ripeto, se poi il costrutto è stato silenziato per effetto posizionale, cosa che può benissimo accadere, o a mosaicismo, la bfp non si vede nemmeno nel topo non incrociato con la linea che porta la cre. Bisognerebbe vedere se il costrutto ha anche degli insulators, che riducono questo rischio. Ma se viene silenziata la bfp, anche la apaf1 farebbe la stessa fine.Comunque uno sceglie le linee migliori tra tutte quelle ottenute, quantomeno quelle adatte al proprio scopo (a volte anche i mosaici fanno comodo).
Il problema del leakage di Cre esiste, ma se il promotore è un buon promotore tessuto-specifico/inducibile o se la cre stessa è inducibile non ci dovrebbero essere problemi.
Spesso questi sistemi si utilizzano per sovraesprimere o eliminare geni del ciclo cellulare, in modo da poter confrontare cellule che hanno il suddetto gene normale da quelle che non ce l'hanno (o lo sovraesprimono o è mutato ecc.) In seguito si fa un analisi clonale, cioè si contano quanti cloni gfp (o bfp) positivi ci sono, quanto sono grossi (in termini di numero di cellule dentro lo stesso clone) e si confrontano con quelli che non hanno la gfp (o bfp). In questo caso tra l'altro la cosa è facilitata dal fatto che quelli senza bfp li posso visualizzare usando lacZ.
Si potrebbe per esempio eseguire una doppia marcatura con anticorpi anti-BFP e anti-LacZ.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 10:38:59
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Certo certo, ma ripeto non sto dicendo che il topo fa schifo e non funziona!!!!
Sto dicendo che un sistema di detezione positivo piuttosto che per sottrazione pone meno problemi.
Ho lavorato con un buon numero di linee cre differenti e ti assicuro che di effetti strani se ne vedono molti. Partire da una base più pulita non può che essere un vantaggio!
Citazione:
Chick80, se hanno usato un reporter che fa schifo, cioè una bfp che si degrada o bleacha subito sono dei brodi, che ti devo dire :).Immagino abbiano usato un buon reporter, almeno spero per loro.
Quello è un problema dei fluorofori blu in generale, non della BFP in particolare. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 11:06:10
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Non sto dicendo che lo hai detto, anzi! Ho semplicemente detto che per me il costrutto e il design sperimentale ha un senso se visto in una certa ottica, quella dell'analisi clonale per fare un esempio. Tutto qui.
Hai ragionissima quando dici che lavorare con basi più pulite da i suoi vantaggi, ma si vedono anche casi inversi, con costrutti apparentemente complicatissimi che funzionano altrettanto bene.
Vabbè, attendiamo allora di sapere la verità sullo schemino |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 11:37:51
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cara gst,
l'osservazione che poni determina non pochi problemi di tipo concettuale e pratico.
il problema concettuale é che un topo così fatto, ovvero che esprime bfp floxato e apaf senza bisogno i cre non ha molto senso logico. Tanto vale mettere apaf senza bfp e senza loxp. 1 strategia molto più semplice e veloce. Il lacz é un reporter molto più sensibile di bfp.
C'é anche un altro problema, ovvero l'impossibilità da parte del topo di esprimere entrambi i cdna con un solo promotore e con una sequenza loxp in mezzo. Sarebbe un'idea balzana per chiunque.
Escludendo l'eventualità dei miracoli e rigiri sofistici su complicati meccanismi ignoti, bisognerebbe ammettere che c'é la seria possibilità che il disegno del costruto che hai riportato non sia corretto.
Ad esempio
Promotore---loxp-bfp-loxp--promotore--apaf_ires_lacz
Oppure
Promotore--loxp-bfp_neo_apaf_ires_lacz
Oppure altro ancora
Ripeto e sottolineo che non este una sola seqenza loxp, ci possono essere delle varianti senza stop e senza atg che però diminuiscono enormemente l'efficienza di riconoscimento da cre.
Per capire meglio dovresti rispondere a dell domande ovvie
1. Come avete fatto la selezione senza il gene della resistenza? Nel costrutto non c'é
2. Dove sono i promotori? Anche questi mancano
3. si tratta di un knock-in o di un transgenico classco? In altre parole come fate la genotipizzazione?
4. L'espressione di bfp e apaf+lacz é coincidente nelle stesse cellule?
5. Sicuro che il topo non abbia già la cre?
6. Che topo transgenico volevate ottenere?
A parer mio la possibilità più semplice e quindi più probabile, escludendo errori nel riportare le informazioni, é che il topo abbia la cre costitutivamente attiva e che ricombini solo una percentuale di cellule che esprimono apaf in stadi precoci, altre cellule non esprimono cre o non sono state ricombinate in entrambi gli alleli e quindi espimono anche la bfp.
Se invece affermi che
1. Il topo non ha cre
2. Apaf non ha un suo promotore
3. Apaf non é fuso con bfp
4. Sono espressi sia bfp che apaf nelle stesse cellule
5. Escludi che si tratti di un topo con mosaicismo
Bhé dovremmo riconsiderare un errore tecnico nel costrutto, un errore nella generazione del topo, errori nel riportare le informazioni, errori sperimetali oppure
Sofisticati e misteriosi meccanismi ignoti di biologia molecolare
Oppure
Miracoli
In bocca al lupo
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