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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
 Inserito il - 26 aprile 2010 : 14:26:43
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Ciao,
lo so, non tutti sono esperti in Virus dell'Epatite C, ma non per questo dovete smettere di leggere il post. Credo infatti che sia un discorso applicabile ad un'ampia casistica, fatalità a me tocca il vurs. Grazie
Ora procediamo. Ciò che mi lascia perplesso è una serie di slide che trattano per l'appunto la determinazione della carica virale dell'HCV con PCR competitiva. Vediamo di dare un filo logico al tutto. Mi ritrovo con una normale PCR competitiva, in cui il mio cDNA di HCV (che è un virus a ssRNA +) è stato amplificato (in realtà solo una porzione al 5', ma tant'è) in "coabitazione" con un competitore e, facendo correre su gel, dal rapporto di intensità tra la banda HCV e competitore, da quanto ho studiato, posso inferire il numero di molecole di cDNA del mio virus in origine. Fin qui tutto occhei.
Ora, ciò che mi disturba è il fatto che accanto a questo esperimento mi ritrovo i dati di una PCR competitiva per la beta-actina. Inoltre, mi ritrovo con un grafico in cui la carica virale in pazienti sottoposti a terapia con alfa-interferone è espressa come "HCV molecules/10^6 b-actin molecules".
Insomma, i miei dubbi sono:
- cosa c'entra la b-actina? E qui suppongo che si tratti di un controllo interno, magari per saggiare l'esito della retrotrascrizione (dato che parto da RNA per HCV). Un chiarimento sul controllo interno (ho dato un'occhiata sul forum, ma per limiti miei vi assicuro che la trattazione non mi ha lasciato soddisfatto);
- che senso ha esprimere la carica virale come "HCV molecules/10^6 b-actin molecules"?
Un grazie per l'attenzione
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 26 aprile 2010 : 16:25:34
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Premesso che non so nulla a riguardo della PCR competitiva,
ti posso dare le uniche nozioni che conosco a riguardo delle
tue 2 domande:
1)Ogni pratica PCR-based di amplificazione di RNA cellulari
necessita strettamente di un controllo interno per normalizzare
la quantità di amplificato d'interesse. La beta-actina è un
housekeeping che funge sia da controllo di RT sia da
normalizzatore, essendo la sua espressione piuttosto
stabile inter-condizioni(questioni di punti di vista, in realtà)
2) Appunto si tratta di una quantità normalizzata, e quindi
indipendente dall'errore casuale dovuto a caricamento di
quantità di RNA totale diverse (ad es. quando si parte da
un numero di cellule diverso..). Il senso è quello di
elidere l'errore casuale e rendere paragonabili i samples. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 26 aprile 2010 : 16:43:18
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Innanzitutto grazie per la risposta!
Il punto che purtroppo continua a sfuggirmi perché dai beneamati appunti di cui dispongo non vi è traccia è il concetto di normalizzazione. Non capisco come e cosa significhi "normalizzare il target con un gene housekeeping".
Se qualcuno mi desse una mano, intanto proseguo le ricerche per conto mio. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 26 aprile 2010 : 17:08:22
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Normalizzare significa esprimere il tuo dato con un numero paragonabile, generalmente una percentuale.
Ad esempio lisi delle cellule e quantizzi il gene A, però a volte potresti avere più cellule a volte di meno, di conseguenza il tuo dato è un po' falsato dalla quantità di mRNA che metti nella reazione.
Per questo motivo si usa un gene X, che rappresenta una costante per il tuo esperimento, e cioé non varia l'espressione in funzione del trattamento che fai.
Il rapporto del gene A su X, in teoria, non dovrebbe variare in funzione della quantità di cellule che metti nella reazione. Premesso che X non varia di espressione, l'unico dato che fa variare il rapporto A/X è proprio l'espressione di A.
Nel tuo caso immagino la seguente situazione.
Il valore di HCV non sarebbe paragonabile ad esempio da paziente a paziente e soprattutto da esperimento ad esperimento, poiché dipenderebbe dalla quantità o qualità dell'estratto ematico. Il rapporto con la actina invece è facilmente rapportabile.
Considera che l'actina sarà espressa tantissimo e la sua espressione è sempre costante, mentre il gene dell'HCV è espresso molto poco e può variare.
Quindi magari si preferisce usare un rapporto HCV / 10^6 Actina per normalizzare il dato e non avere un valore eccessivamente elevato. Il 10^6 come ho già detto serve per non avere un valore eccessivamente elevato.
N.B.: 10^6 non è un fattore di moltiplicazione dell'actina, bensì dice di esprimere il valore dell'actina in milioni di unità. Per cui equivarrebbe ad un 10^(-6) x Actina.
si dice competitiva la PCR poiché l'actina e l'HCV sono amplificati nella stessa provetta. Credo tuttavia che si usi sono nella pcr classica, nella real-time può anche non essere competitiva se non si usano sonde specifiche.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 aprile 2010 : 18:05:23
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Citazione:
Messaggio inserito da Neuroscience
si dice competitiva la PCR poiché l'actina e l'HCV sono amplificati nella stessa provetta. Credo tuttavia che si usi sono nella pcr classica, nella real-time può anche non essere competitiva se non si usano sonde specifiche.
Credo siano due PCR distinte però.
PCR competitiva per HCV: HCV + competitore
PCR competitiva per actina: actina + competitore
ottieni dei risultati "semiquantitativi" da entrambe e poi normalizzi rispetto all'actina.
@0barra1: spero il concetto di "normalizzatore" sia chiaro ora, ma nel caso ti faccio un esempio banale.
La quantità di actina è "costante" nei vari campioni (con le dovute riserve illustrate prima e i altre discussioni), poniamo che tu abbia 10 molecole di actina in una cellula (numeri del tutto fasulli!).
Fai il tuo esperimento cercando di partire per tutti i campioni da 10 cellule, quindi la tua actina dovrebbe essere 100.
Ma nella pratica (per vari motivi) non si è mai così precisi, quindi osservi valori di actina di 100, 110, 80...
questo ti dice che hai utilizzato 10, 11 e 8 cellule.
Se tu guardassi solo il tuo gene di interesse potresti commettere degli errori dovuti a questo fatto, ad es. ottieni questi valori del tuo gene: 4, 3, 3 e concluderesti che il secondo e il terzo campione hanno la stessa quantità del gene di interesse.
In realtà questo è sbagliato perchè il terzo campione ha meno cellule, se infatti calcoli anche l'actina e normalizzi rispetto a questa ottinei:
4/100, 3/110, 3/80
e i valori normalizzati saranno:
0,04; 0,027 ; 0,0375
quindi il terzo campione ne ha di più del secondo.
Per questo motivo è importante normalizzare quando si fanno delle quantificazioni.
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 26 aprile 2010 : 19:48:43
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uhmm...
Il competitore cosa sarebbe quindi? E come si distinguerebbe dal campione in analisi? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 aprile 2010 : 20:21:14
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E' appunto una PCR competitiva, tecnica ormai sorpassata da quando c'è la real-time a prezzi abbordabili.
In breve si aggiunge alla mix di PCR un "competitore" (stampo simile al DNA che si vuole analizzare) a concentrazione nota, questo "competerà" con il DNA X per i primers e gli altri reagenti.
L'amplificato del competitore è in genere distinguibile perchè è leggermente più grande/piccolo di quello del DNA X. Ottieni quindi 2 bande, a parità di quantità di competitore/DNA X le 2 bande hanno la stessa intensità, man mano che aumenta la quantità di DNA X in soluzione aumenterà l'intensità della banda X e diminuirà quella del competitore.
In questo modo, confrontando le 2 bande, è possibile fare una sorta di quantificazione.
Scusa lo davo per scontato, ma forse non avrei dovuto. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 26 aprile 2010 : 23:09:09
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per me continua a non avere senso.
La normalizzazione dell'actina dovrebbe già di per sè bastare per la quantizzazione relativa.
Il rapporto tra il gene x ed il competitore sarà x/cx, mentre il rapporto tra l'actina a ed il suo competiore sarà a/ax
Il rapporto che ne viene fuori é (c/cx)/(a/ax)= c*ax / a*cx
Se ax e cx li inserisco io e li metto sempre nelle stesse dosi daranno una costante ax/cx=k
Ne viene fuori (c/a)*k il che é proporzionale a c/a
In pratica fare una doppia competizione nel gene x e nel suo controllo equivale a non farlo in alcun modo.
La tecnica che citi, se ricordo bene, serviva per fare una quantizzazione assoluta di un gene con la pcr classica.
Il competiore era a concentrazione nota e da questo rapporto si intuiva la concentrazione incognita del campione. Ma in questo caso non ne vedo il senso dato che il campione é normalizzato per l'actima e non serve una quantizzazione assoluta.
Forse mi sfugge qualcosa |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 aprile 2010 : 11:20:20
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Forse quello che ti sfugge è come funziona la PCR competitiva e i risultati che dà.
Non fai un rapporto tra gene x e competitore (x/cx), non è una normalizzazione ma ti serve per quantificare il gene x nel tuo campione.
Provo a spiegarmi meglio, se fosse una "normalizzazione" tu dovresti avere un livello costante del competitore nel campione che si rifletterebbe su una banda di intensità costante (quella del competitore) in tutte le PCR, cioè se io metto il competitore a concentrazione nota, poniamo 100 devo osservare una banda di intensità 100. Questo sarebbe vero (senza considerare i limiti della PCR end-point) se io utilizzassi come stampo solo il competitore.
Ma qua sta il "trucco" della PCR competitiva, gli stampi sono 2 e "competono".
Risultato:
- se ho poco gene x questo non riuscirà a competere con il competitore che quindi sarà favorito nell'amplificazione e osserverò una grossa banda per "cx" e una molto debole per "x"
- all'aumentare del gene x ho più molecole che riescono a competere, quindi la banda "x" aumenta e "cx" diminuisce
- ovviamente se ho moltissimo gene x la situazione sarà opposta, grossa banda "x" e debole banda "cx"
- ma il punto che mi interessa è quello in cui le due intensità sono "uguali", li posso dire che ho la "stessa" quantità di gene x e competitore, sapendo quanto è il competitore so di conseguenza quanto è il gene x. Quindi in quel punto (quella PCR) posso dire che ho 100 di gene x.
Ovviamente fai varie PCR diverse concentrazioni (note!) di competitore, ad es. 10, 20, 30... in questo modo vedi in quale delle PCR hai le due bande più o meno uguali e da questo "deduci" la quantità del gene x.
Ovviamente si tratta di una stima, non è di certo una misurazione precisa.
Metto la figura per essere più esaustiva.
Come vedi nella PCR 5 le bande sono più o meno uguali, quindi puoi dire che la concentrazione del gene x corrisponde alla concentrazione di competitore che c'è in quel campione.
EDIT: mi accorgo ora che non sono stata precisissima nella spiegazione, ma non voglio riscrivere tutto. Preciso solo che nella prima parte della spiegazione ho considerato il competitore costante e il gene x variabile, per spiegare il funzionamento della PCR competitiva.
Nella seconda parte con l'esempio, anche per adeguarmi alla figura, invece è considerato il gene a costante (stesso campione) e il competitore varia.
Comunque il senso non varia. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 27 aprile 2010 : 11:44:22
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adesso è ancora più chiaro il mio dubbio.
Questa procedura serve per avere una sorta di quantizzazione assoluta...
ma se alla fine tu paragoni il gene x rispetto all'actina ed ottieni un rapporto, poiché è quello che alla fine ti interessa... che importanza ha fare tutta questa procedura e non fare direttamente il rapporto gene x su actina?
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 aprile 2010 : 11:59:59
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E' semplicemente un modo per "quantificare", avere un numero.
Tu con una PCR real-time ottieni dei valori, poi questi li normalizzi rispetto all'actina.
Con una PCR end-point non puoi ottenere dei valori, proprio per il fatto che è end-point e analizzi il prodotto quando la reazione è in fase di plateau.
Se anche tu analizzassi i vari campioni con quantità diverse di gene x molto probabilmente otterresti in tutti lo stesso risultato, banda con la stessa intensità, c'è un limite oltre il quale non potresti andare, non puoi quantificare!
La PCR competitiva ti serve per "quantificare", cosa impossibile altrimenti con una PCR end-point.
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 27 aprile 2010 : 12:17:14
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il fatto che la pcr sia end-point non significa un gran ché, prima della real-time si facevano vari punti con diversi cicli per dimostrare che ti trovavi nella fase esponenziale e quindi quantificabile.
Credo che sia un principio che valga ancora, sia nella pcr competitiva che non competitiva. Se non si applica questo concetto anche la pcr competitiva ha dei problemi a quantizzare.
Detto questo credo che sia una cosa da indagare meglio nel dettaglio, perché così descritta non mi sembra convincente.
Con la pcr classica semiquantitativa si estraggono comunque dei numeri, li ho pubblicati in passato ed ho fatto da referee ad altri che hanno fatto lo stesso modo. Certo che ora si consiglia sempre di fare la Real-time, ma il principio è lo stesso c'è solo una maggiore sicurezza e precisione del dato scientifico. In entrambi i casi si ottengono dei valori che si normalizzano per l'actina.
La mia perplessità è proprio sulla necessità di quantificare in maniera assoluta per ottenere alla fine una quantizzazione relativa.
Come fare una real time pcr assoluta e poi fare i rapporti per ottenere una quantificazione relativa... tanto vale fare direttamente la quantificazione relativa se è solo quello che ti interessa.
Indagherò meglio sulla questione, credo che valga la pena togliersi questo dubbio.
n.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 aprile 2010 : 12:50:09
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Beh se vuoi approfondire sulla PCR competitiva credo che tu non abbia ti certo bisogno di aiuto a trovare materiale.
Sicuramente puoi quantificare con una PCR end point facendo meno cicli e cercando di stare nella fase esponenziale, ma la messa a punto non è certo facile e anche l'affidabilità credo non sia il massimo.
Semplicemente la PCR competitiva è una tecnica che permette di ovviare a molti problemi e a fare una quantificazione più accurata, punto. Questo è il senso della PCR competitiva e il motivo per cui è stata inventata.
Quindi tornando all'inizio è un metodo per quantificare, e su questo spero che siamo d'accordo, la stessa quantificazione (più o meno accurata) la potresti fare con altri metodi, nel caso di questa discussione è stata utilizzata la PCR competitiva, ok?
Poi normalizzi e quindi usi actina, e i motivi per cui si fa una normalizzazione mi sembra che li abbiamo spiegati ampiamente.
Questo è semplicemente come è stato questo esperimento descritto all'inizio.
A questo punto non mi è chiara una cosa del tuo discorso, tu dici: io non avrei fatto una PCR competitiva, ok.
Cosa avresti fatto?
Una PCR in cui amplifichi nella stessa provetta gene x e actina e poi il rapporto delle 2 bande? E' questo che intendi?
Se si come avresti fatto per ovviare il problema del plateau nella PCR end point?
Cercando di mettere appunto varie PCR in modo da lavorare nella fase esponenziale? Cosa forse non molto facilissima per una multiplex, ma anche fatto non avresti fatto altro che quantificare con un altro metodo rispetto alla competitiva.
Io sinceramente non ci vedo tutta questa differenza. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 27 aprile 2010 : 13:23:56
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Forse ho trovato...
Allora per rispondere alla tua domanda
Sì, un po' di tempo fa richiedevano nella pcr semiquantitativa un doppio amplificato nello stesso tubino, non si tratta di una multiplex ovviamente ma è un suo antenato.
La problematica che si poneva tempo fa era
1. La fase di planteau che risolvevamo come già accennato
2. L'altra problematica che si poneva sempre più insistente tra i referee, che trovo tra l'altro anche giusto, che tra un tubino e l'altro ci può essere un errore di pipettamento o addirittura in certi casi la pcr potrebbe non venire o essere meno intenso, per motivi diversi.
Per risolvere questo dubbio si doveva necessariamente amplificare il tuo gene ed il suo controllo nello stesso tubino e fare delle prove per non andare a plateau per entrambi i geni. Era una cosa rompiscatole ma ci si riesce. Lo facevo quando ero tesista, non ero certo un genio, e lo facevano anche altri. Devo dire che al tempo non era neanche tanto diffusa la quantizzazione al chemidoc o geldoc, ma ci si riusciva comunque.
Ovviamente la Real-time ha risolto tutti questi fastidiosi problemi.
Tenuto presente che alla fine ottieni sempre il rapporto tra gene X e suo controllo... fare meno passaggi e soprattutto con tecniche che hanno meno variabili sarebbe conveniente per tutti.
Soprattutto poi generare e quantificare un pezzo di pcr più lungo o più corto con gli stessi oligo etc da usare per ogni pcr. Anche lì ci potrebbero essere dei problemi.
Credo che alla fine ci sia una differenza fondamentale che non avevo considerato prima.
Ovvero che il rapporto tra il gene x e l'actina sarebbe dipendente dal laboratorio che fa l'analisi, dalla taq usata, dalla scelta dei primers, etc poiché sarebbero unità arbitrarie.
Come paragonare l'intensità di fluorescenza di una PCR, ovvio che dipende dalla grandezza dell'amplificato, dalla qualità della taq, dal numero di cicli etc etc.
Invece con il metodo che hai citato si farebbe un rapporto su un numero preciso di molecole che è indipendente dalla tecnica o dal laboratorio che ha fatto l'analisi.
Questo passaggio non mi era venuto in mente, pensavo alla classica analisi in cui si pone un controllo gene x/actina pari al 100% e poi un trattato gene x/actina del 120% e si vede un aumento del 20% qualsiasi siano stati i valori assoluti del gene x.
In questo caso invece si misura il rapporto del numero di molecole di HCV su Actina che dovrebbe rappresentare un valore assoluto per la valutazione della carica virale, un po' come contare i globuli rossi per ml in un individuo.
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 01 maggio 2010 : 14:17:23
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Scusate se non vi ho risposto prima, non sono solito ignorare i topic ch'io stesso apro, ma sono oberato di lezioni e studio pre-esame da molto ormai.
Ringrazio Neuroscience e GFPina per le delucidazioni, da cui ho tratto molto vantaggio. Ragazzi, dovreste scrivere un manuale, di spiegazioni migliori e più ragionate se ne vedono poche in giro.
Mi resta un dubbio: se la competizione beta-actina/competitore avviene in un tubino diverso dalla competizione gene x/competitore, non c'è il rischio avere comunque delle discrepanze significative con la realtà? |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 01 maggio 2010 : 15:32:08
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bhé tenendo presente che siamo sempre sotto il cielo, grosso modo le variabili in gioco diventano indipendenti dal rusultato.
Sottolineo che c'é comunque la necessità di farlo con la supervisione di un responsabile esperto; in altro modo verrebbe a cadere il discorso.
Non so esattamente a che ti riferisci con la variabilità, provo ad ipotizzarne alcune:
1. Campione sporco e quindi pcr difficile. Capiterebbe sia al tuo gene che al controllo a pari condizioni.
2. Fenomeni strani o errori di pipettatura. Capita sempre, é per questo che si ripetono gli esperimenti.
3. Una pcr viene meglio, l'altra pegggio. Non é importante, é importante solo quello che accade nell'ambito dello stesso tubino. Il rapporto con il competitore a concentrazione nota é un parametro da cui si ricava la concentrazione assoluta del campione.
I fenomeni di saturazione e quantificabilità ovviamente sono eliminati dalla premessa fatta.
Altre condizioni non le immagino.
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PCR competitiva e HCV
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