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annatrippa
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
 Inserito il - 06 maggio 2010 : 14:26:32
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salve, sono nuova del forum e vorrei chiedervi un consiglio.
devo fare uno screening su dei lieviti tramite pcr e volevo saper se esiste un metodo rapido per l'estrazione di dna.
grazie mille
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Morfeo
Nuovo Arrivato
Città: Roma
110 Messaggi |
Inserito il - 06 maggio 2010 : 17:41:32
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Ciao, guarda ti posso scrivere il protocollo che ho usato io, non è così rapido, ma penso che per fare l'estrazione del dna genomico ad ogni modo un pò di tempo ci vuole. L'unica cosa ti serve un pò di materiale che non so se hai in lab, tipo le glass beads (palline di vetro, le vende la sigma).
-Centrifugare la coltura (qua ho scritto da 10mL YPD, poi dipende da che volume hai)per 5' a 3500rpm ed eliminare il supernatante (mi raccomando non lasciare capovolta la provetta come si fa per i batteri perchè il pellet di lievito è più delicato)
-Risospendere le cellule in 1 mL di H2O e trasferire in una eppendorf da 1,5mL
-Centrifugare 1' a 13200rpm ed eliminare il supernatante (col puntale)
-Risospendere le cellule in 200microL di Breaking buffer
-Trasferire la sospensione di cellule in una eppendorf da 1,5mL contenente 200microL di fenolo, cloroformio,alcool isoamilico 25:24:1 e 0,3 gr di glass beads (sono circa 200microL)
-Vortexare per 3'
-Aggiungere 200microL di TE
-Centrifugare 5' a 13200rpm
-Recuperare la fase acquosa e aggiungere 1mL di etanolo 100% , mettere a -20°C per 10'
-Centrifugare 10' a 13200 rpm
-Lavare con 500microL di etanolo al 70%
-Centrifugare 5'
-Asciugare il pellet a 37°C
-Risospendere il pellet in 100microL di H2O
Questa diciamo che è la versione corta, comunque per fare le pcr va benone se tu volessi fare una cosa ancora più pulita, ci sono altri passaggi con RNAsi, etanolo, ammonio acetato ecc.
Spero ti sia utile.
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